中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (2): 234-235   PDF    
引用本文
林辉, 宋启发, 郑剑, 徐景野, 金春光. 铜绿假单胞菌1型整合子与多重耐药性关系[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(2): 234-235.
LIN Hui, SONG Qi-fa, ZHENG Jian, et al. Relation between class 1 integrons and multiple drug resistance in pseudomonas aeruginosa[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(2): 234-235.
铜绿假单胞菌1型整合子与多重耐药性关系
林辉, 宋启发, 郑剑, 徐景野, 金春光     
浙江省宁波市疾病预防控制中心微生物检验科, 315010
收稿日期: 2006-05-25
作者简介: 林辉(1955-), 女, 浙江人, 副主任技师, 中专, 主要从事卫生微生物检验工作。
摘要: 目的 了解铜绿假单胞菌1型整合子携带情况及耐药性, 探讨其与多重耐药的关系, 为烧伤患者抗生素选择提供依据。 方法 采用PCR技术对26株分离于烧伤病房的铜绿假单胞菌进行1型整合子检测; 用K-B纸片法检测细菌对13种抗菌药物的耐药谱; 分析1型整合子与铜绿假单胞菌多重耐药的关系。 结果 26株铜绿假单胞菌检出携带1型整合子16(61.5%); 整合子阳性菌株对13种抗生素耐药率由高到低依次为妥布霉素、氧氟沙星和庆大霉素(93.8%)、环丙沙星(87.5%)、头孢曲松和头孢噻肟(62.5%)、阿米卡星(56.2%)、安典南(50.0%)、亚胺培南和头孢哌酮(43.8%)、头孢吡肟、哌拉西林和头孢他啶(37.5%)。26株铜绿假单胞菌的多重耐药率(耐4种以上抗生素)为61.5%(16/26), 其中1型整合子阳性菌株多重耐药率占93.8%(15/16), 阴性菌株多重耐率为10%(1/10), 1型整合子阳性菌株多重耐药率明显高于阴性株(P < 0.01)。 结论 铜绿假单胞菌1型整合子阳性携带率较高, 并与多重耐药有密切关系。
关键词： 铜绿假单胞菌     1型整合子     多重耐药    
Relation between class 1 integrons and multiple drug resistance in pseudomonas aeruginosa
LIN Hui, SONG Qi-fa, ZHENG Jian, et al     
Ningbo Center for Disease Control and Prevention of Zhejiang Province, Ningbo 315010, China
Abstract: Objective To investigate the class 1 integrons in pseudomonas aeruginosa isolated from burn units, study the relation between class 1 integrons and multiple drug resistance, and advise the selection of antimicrobiol drugs for the treatment of burn patients. Methods Class 1 integrons in 26 pseudomonas aeruginosa isolates were detected with PCR.K-B drug susceptibility method was performed to test profile of drug resistance against 13 drugs.The relation between class 1 inte-grons and multiple drug resistance was analyzed. Results 16 isolates in 26 were identified class 1 integron positive (61.5%).Bacterial drug resistance rates of strains with class 1 integrons against the following drugs were determined:to-bramycin (93.8%), ofloxacin (93.8%) gentamicin (93.8%), ciprofloxacin (87.5%), cefatriaxone (62.5%), cefotaxime (62.5%), amikacin (56.2%), aztreonam (50.0%), imipenem (43.8%), cefoperazone (43.8%), cefepime (37.5%), piperacillin (37.5%) and ceftazidime (37.5%).Among 16 multiple drug resistant isolates (resistant of≥4 drugs tested) in total 26 isolates (61.5%, 16/26), 15 were class 1 integron positive (93.8%, 15/16) and 1 was class 1 integron negative (10%, 1/10).It showed that strains with class 1 integrons had significantly higher incidence of multipe drug resistance than those without (P < 0101). Conclusion High incidence of class 1 integrons was found in pseudomonas aeruginosa isolates and close relation existed between class 1 integrons and multiple drug resistance.
Key words: pseudomonas aeruginosa     class 1 integrons     multiple drug resistance    

铜绿假单胞菌(PA)是医院感染常见条件致病菌〔1〕, 并且是烧伤病人感染的重要病原菌。近年来抗生素的广泛使用, 使PA的多重耐药性越来越严重。研究显示, 这主要与PA存在外膜通透性下降和外膜主动药物外排系统等耐药机制有关, 另外1型整合子也是造成PA广泛耐药的重要原因〔2, 3〕, 目前已发现1型整合子携带的耐药基因有40余种。本文对分离于烧伤病房环境和病人创面的26株PA的1型整合子携带情况及耐药性进行分析, 探讨1型整合子与PA多重耐药的关系。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

2005年1月收集宁波市某医院感染调查中分离的PA26株, 其中18株分离自烧伤病房床头柜、床沿、医务人员手、操作台、医生值班室、办公室和操作台等涂抹标本, 8株分离自烧伤病人创面。分离、培养并鉴定后由VITEK细菌鉴定仪确认。用Luria-Bertani液体培养基200 r/min振荡培养8 h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌(带有aadA1和sull耐药基因盒)为本实验室分离株经测序证实, 作为PCR实验阳性对照。

1.1.2 试剂

基因组提取试剂、PCR产物纯化试剂、PCR试剂、Long PCR试剂、dNTP和DNA marker 2000, 1000, 750, 500,250,100 bp(日本TaKaRa公司); MH琼脂和药敏纸片(英国Oxoid公司)。

1.2 方法 1.2.1 药物敏感试验

采用K-B纸片扩散法, 对13种抗生素进行检测, 结果判断按照2005版美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)微生物敏感性试验执行标准。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2.2 PCR筛选1型整合子阳性菌株

PCR引物(上海塞百盛生物工程公司合成); 1型整合子筛选引物primer 1扩增Ⅰ型整合子5'端保序列intI1基因(GenBank, Access no. AF133699), F引物为5'-TCTGGACCAGTTGCGTGAGC, R引物为5'-CCGAGACCAATAGCGGAAGC。煮沸法制备细菌基因组模版, 分别用2对1型整合子筛选引物primer1和primer2扩增。反应体系为:50 μl总体积, 10×PCR buffer (含Mg2+2.5 mmol/L) 5 μl, 引物各40 pmol, dN TP各10 μmol, Taq酶2.5单位, 模版2 μl。反应条件:94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 共30个循环, 最后72 ℃延伸5 min。

2 结果 2.1 1型整合子筛选结果

26株PA菌株中, 检出1型整合子阳性菌株16株, 阳性率为61.5%, 分别由primer1(图 1)和primer2(图 2)扩增出237和408 bp片段, 表明该16株菌株携带1型整合子。

M:DNA marker; 1, 3, 4, 6, 7, 9~12, 14, 17, 21~24, 26:携带I型整合子阳性株, 其他为阴性株 图 1 2株PA整合酶基因5′端保守序列intl1扩增结果(primer1扩增, 237 bp)

M:DNA marker; 1, 3, 4, 6, 7, 9~12, 14, 17, 21~24, 26:携带I型整合子阳性株, 其他为阴性株 图 2 26株PA整合酶基因3′端保守序列sul1阳性结果(primer2扩增, 408 bp)

2.2 1型整合子阳性株与阴性株耐药率比较

1型整合子阳性株对13种抗生素耐药率由高到低依次为妥布霉素、氧氟沙星和庆大霉素(93.8%)、环丙沙星(87.5%)、头孢曲松和头孢噻肟(62.5%)、阿米卡星(56.2%)、安曲南(50.0%)、亚胺培南和头孢哌酮(43.8%)、头孢吡肟、哌拉西林和头孢他啶(37.5%); 阴性株除对头孢噻肟耐药率为20%, 对安曲南、头孢吡肟的耐药率各为10%外, 其余菌株耐药率均为0。1型整合子阳性株与阴性株耐药率差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.3 1型整合子与多重耐药率的相关性

多重耐药率(耐4种以上抗生素)为61.5%(16/26), 其中1型整合子阳性菌株多重耐药率占93.8% (15/16), 阴性菌株多重耐药率为10% (1/10)。1型整合子阳性菌株多重耐药率明显高于阴性株, 差异有统计学意义(χ2=18123, P < 0.01)。

3 讨论

本文结果表明, 1型整合子在PA耐药性产生的遗传机制上起着重要作用, 它是引起细菌多重耐药的重要因素。1型整合子产生于细菌基因组进化, 在耐药基因捕获和转移中发挥重要作用, 能够不断从外界获得耐药基因并将其整合在一起, 使其结构处于不断发展进化中〔3〕。由于抗生素使用量和种类日趋增多, 使各种细菌生存面临更多抗生素环境。新的抗生素不断出现和使用, 如头孢四代以及以前不常使用的抗生素现在已经普遍使用, 如20世纪90年代初还比较昂贵的头孢氨苄。抗生素的使用越广泛, 使携带新耐药基因的优势菌越多, 并导致携带耐药基因菌群量更大, 包括许多革兰阳性菌也为1型整合子提供耐药基因盒〔4〕。为了控制烧伤患者感染, 往往大剂量使用抗生素, 这为携带1型整合子多重耐药细菌提供了选择性压力, 可能使其耐药种类更多, 传播更广泛。因此, 这种耐药机制引起的细菌耐药应该引起烧伤病房等收治危重患者医疗部门的重视, 加大监测力度, 预防医院感染的发生。

参考文献
[1] 王辉, 陈民钧. 1994~2001年中国重症监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁[J]. 中华医学杂志, 2003, 83 : 385–390.
[2] Rowe-Magnus DA, Mazel D. The role of integrons in antibiotic resistance gene capture[J]. Int J Med Microbiol, 2002, 292(2) : 115–125. DOI:10.1078/1438-4221-00197
[3] Dean A Rowe-Magnus, Anne-Marie Guerout, Didier Mazel. Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes[J]. Mol Microbiol, 2002, 43(6) : 1657–1669. DOI:10.1046/j.1365-2958.2002.02861.x
[4] Sobhan Nandi, John J Maurer, Charles Hofacre, et al. Gram-positive bacteria are a major reservoir of class 1 antibiotic resistance integrons in poultry litter[J]. PNAS, 2004, 101(18) : 7118–7122. DOI:10.1073/pnas.0306466101