肾综合征出血热(HFRS)是一种严重危害人体健康的自然疫源性疾病。在各种预防HFRS的措施中, 疫苗是一种最特异和最有效的预防手段。迄今为止, 本实验室已经研究出HFRS Ⅰ型、Ⅱ型和双价及双价纯化沙鼠肾灭活疫苗并已投入规模生产。经现场流行病学调查, 疫区人群的保护率在95%以上, 为预防HFRS起到了重要的作用^{〔1, 2〕}。但疫苗的毒种Z 10野鼠型(HTN)和Z 37家鼠型(SEO)均为20世纪80年代分离, 距今已将近20年, 随着时间的推移, HFRS的流行及临床症状有较大的变化, 这预示着引起该病的病毒有可能发生变异。因此, 必须选择疫苗的后备毒株, 一旦发生目前疫苗保护率不高或不能保护时, 即可用后备毒株生产疫苗。2001~2002年, 我们从浙江省的HFRS疫区鼠肺中分离到了9株汉坦病毒, 筛选出病毒滴度较高、抗原性较好的4株毒株^〔3〕, 再将4株毒株在Vero细胞中的增殖特性、抗原性和免疫原性进行研究, 从中筛选出ZJ4与ZJ5毒株为汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗理想的候选毒株。现将筛选的过程及结果报道如下。

均由中国药品生物制品检定所惠赠, 经本室传代保存, Vero细胞使用代次不超过150代, Vero-E6使用代次为30~60代之间。

ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5毒株由本室采用20 d龄左右沙鼠分离自浙江省HFRS疫区捕获的野外鼠阳性鼠肺标本; 76-118(HTN)和UR (SEO)株(中国药品生物制品检定所疫苗一室)。所有毒株使用前均经第四军医大学汉坦病毒单克隆抗体鉴定型特异性。其中对ZJ4、ZJ7毒株部分M片段核苷酸序列进行了测定, 结果也证明属HTN型^〔4〕。

出生20 d左右的沙鼠和2~5 d龄的乳沙鼠(系本实验室饲养); 家兔(浙江省药品检定所), 白毛, 体重2~3 kg, 雌雄不限。

HFRS荧光血清抗体和兔抗HFRS IgG致敏血球为本室自制。

将分离到的毒株接种1~5 d龄的乳沙鼠, 每只脑内0.02 ml, 15 d左右收获, 无菌取脑, 用含10%小牛血清基础建立培养液(MEM)液制成鼠脑悬液, 离心取上清, 在Vero-E6细胞上测定病毒滴度以及利用反向被动血凝试验(RPHA)测定病毒抗原。需要传代的将脑悬液接种1~5 d龄乳鼠, 每只脑内0.02 ml。

分别将汉滩病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株鼠脑标本研磨制成10%的鼠脑悬液, 离心后取上清液接种Vero细胞, 进行适应性传代, 培养7 d左右, 取细胞刮片进行直接免疫荧光法(FA)^〔5〕检查细胞感染情况, 待感染量达+ + +~+ + + +, 将细胞瓶冻入-30 ℃冰箱, 过夜后融化离心, 取上清传代, 连续传5代, 每代取细胞冻融液少许, 用来测定病毒和抗原滴度。

将4株毒株感染长成单层的Vero细胞, 37 ℃培养, 每隔3 d用含3%小牛血清的MEM换液1次, 并逐日在倒置显微镜下观察细胞病变发展情况, 连续观察12 d。

候选的4株毒株在Vero细胞上适应了5代后, 将细胞冻融后离心的上清液(CP₅)腹腔注射2~5 d龄的乳沙鼠, 0.1 ml/只, 观察乳鼠的发病情况并记录发病或死亡时间。

用0.25%胰酶消化生长良好的Vero-E6细胞, 以适应细胞浓度接种96孔微量培养板, 每孔150 μl, 置37 ℃、5% CO₂条件下培养, 待细胞长成单层, 取待检毒种液, 做10倍系列稀释, 分别接种到E6单层细胞孔, 接种量为10 μl/孔, 每个稀释度接种4种, 置37 ℃、5% CO₂条件下吸附2 h, 然后加3%小牛血清MEM的细胞培养液150 μl/孔, 再置37 ℃孵箱培养6~7 d, 用FA检查细胞感染病毒的情况, 计算病毒滴度。

采用96孔120°“V0”型微量反应板, 每孔加25μl RPHA稀释液, 取25μl待检毒种液于第一孔作1:2, 1:4, 1:8, ,倍比稀释, 然后每孔加25 μl致敏血球悬液, 于微量震荡器上混匀并置37 ℃水浴1~2 h观察结果。

选用ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5株作为疫苗株, 将此毒株感染Vero单层细胞, 培养后按生物制品规程中肾综合征出血热疫苗生产的方法研制疫苗^〔6〕, 最后以1:4000β-丙内脂灭活。

制成的疫苗经安全试验合格后(Vero-E6细胞盲传3代阴性), 用于免疫家兔, 每批4只, 后腿肌肉注射1.0 ml, 7 d后以同法再免疫1次, 第1次免疫后4周采血分离血清。每只家兔于免疫前4周采血, 分离血清作为对照。应用间接免疫荧光法(IFA)^〔5〕和本实验室建立的半微量直接免疫酶斑减少中和试验(DPPRNT)^〔7〕测定荧光抗体和中和抗体的效价。病毒用汉坦病毒国际标准株76-118和UR株。

ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5毒株在乳沙鼠脑中连续传了8, 8, 5, 7代, 其鼠脑冰冻切片经直接免疫荧光检查均呈强阳性, 鼠脑悬液经离心, 上清液的病毒滴度和抗原滴度均较强。

4株毒株对Vero细胞均很敏感, 但适应能力存在一定差异。ZJ4、ZJ7株接种Vero细胞第2代的免疫荧光强度即达到+ + +, 而ZJ2、ZJ5株荧光相对较弱, 经5次传代, 4株毒株的免疫荧光强度和病毒滴度均有明显的提高, 免疫荧光强度均可以达到+ + + +, ZJ2、ZJ4、ZJ7三株HTN型病毒呈片状荧光, ZJ5株SEO型病毒呈颗粒状荧光, 结果传5代后4株毒株的病毒滴度均达到6.50 LgCCID₅₀/ ml, 最高达7.50 LgCCID₅₀/ ml, 病毒抗原量均达到1:160, 最高达1:768, 随着适应代数的增加, 病毒滴度和病毒抗原量呈递增趋势, 递增情况(表 1)。

表 1

表 1 4株毒株经Vero细胞传代后不同代次的病毒滴度和抗原滴度

表 1 4株毒株经Vero细胞传代后不同代次的病毒滴度和抗原滴度

连续观察12 d, 4株毒株的1~5代均不使Vero细胞产生病变。

4株毒株的CP₅攻击乳鼠, 7 d后均发现乳鼠活动减少, 精神萎靡, 卷缩, 后肢麻痹等症状发生, 9 d后出现死亡。

用ZJ4株和ZJ5株制备的2批单价原液灭活疫苗免疫家兔, 2针后的免疫血清经DPPRNT测定, 对同型毒株的中和抗体效价, 3/ 4只家兔不低于1:10。

本结果显示, 经5代传代后, 病毒在Vero细胞上已较好适应, 病毒滴度和抗原量均有明显提高。病毒滴度均稳定在6.50 LgCCID₅₀/ ml以上, 病毒抗原量稳定在1:160。同时将筛选出的毒株制成Vero细胞灭活疫苗, 疫苗免疫家兔后, ZJ4和ZJ5株疫苗的免疫血清4/ 4和3/ 4的家兔中和抗体滴度不低于1:10, 表明有很好的免疫原性, 在家兔体内可以诱导出较高效价的中和抗体。因此, 设想今后将ZJ4和ZJ5株毒株在Vero细胞上增加传代次数, 研制HF RS双价纯化Vero细胞灭活疫苗, 可能会更提高免疫血清的抗体效价。目前衡量汉坦病毒疫苗质量好坏非常重要的一个指标是免疫原性-中和抗体的效价。中国生物制品规程中评价HFRS疫苗质量的免疫原性标准是3/ 4的家兔中和抗体滴度应不低于1:10。将ZJ4和ZJ5毒株经乳沙鼠脑内连续传8, 7代后的鼠脑毒种经Vero细胞适应5代后再反传乳鼠, 收获病鼠, 其鼠脑经脱脂牛奶稀释后真空冷冻干燥后建立毒种库, 根据2005版的《药典三部》^〔8〕对疫苗毒种的要求, 对其进行了外源因子、无菌试验、支原体等检测, 均符合疫苗生产规程的要求。