近年来, 随着对锰的生殖毒理、生殖流行病学和生殖生化领域的研究进展, 锰对男性生殖系统的损害已渐渐受到重视, 并提出以精子数量、精子形态结构和精子运动能力等作为衡量环境有害因素对雄性生殖机能影响的重要观察指标^〔1〕。为此, 本文对小鼠精子数量、畸形率和活动度进行了研究。

1 材料与方法 1.1 实验动物

6~8周雄性昆明种小鼠100只, 体重23~28 g (贵阳医学院实验动物中心), 合格证号为SCXK 2002-0001。随机分为4组, 即3个不同剂量MnCl₂组(715, 15, 30 mg /kg)和对照组, 分别给予腹腔注射MnCl₂和等量生理盐水, 1次/d, 每周5 d, 每组25只, 每周测小鼠体重, 调整用锰量。

1.2 主要试剂

MnCl₂·4H₂O (中国医药集团上海化学试剂公司)。

1.3 标本收集

分别于染锰3, 7, 14, 28, 56 d随机每组取5只小鼠, 脱臼处死, 立即分离附睾。

1.4 精子计数

参照文献〔2〕。

1.5 精子活动度

参照文献〔2〕。精子活动度分级参照WHO推荐的方法, 按精子游泳状态将精子活动度分为4级^〔3〕。精子活动度=(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)×100%。

1.6 精子畸形率

取上述精子悬液500 μl, 加入2%伊红溶液50 μl, 染色1 min, 涂片, 甲醇固定。油镜下观察1 000个精子/只, 用‰表示精子畸形率^〔4〕。精子畸形分类参照文献〔5〕的方法。

1.7 统计分析

采用SPSS 11.0统计软件进行分析。所得计量资料用x±s表示, 用F分析进行检验; 精子活动度采用χ²检验; 精子畸形率用Poisson分布进行检验。

2 结果 2.1 氯化锰对小鼠精子数量的影响(表 1)

各组在染锰第3, 7 d精子计数与对照组比较, 差异无统计学意义(P > 0.05);染锰14 d, 30mg/kg组精子计数开始降低, 与对照组比较, 差异有统计学意义(P < 0. 05);染锰28 d, 3个染锰组精子计数与对照组比较, 差异有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01, P < 0.01);至染锰56 d, 3个染锰组精子计数均显著降低, 与对照组比较, 差异有统计学意义(P < 0.01), 精子数量随染锰剂量增加和时间延长逐渐减少。

2.2 氯化锰对小鼠精子畸形率的影响(表 2)

畸形精子的类型以无钩、香蕉头和不定形为主, 在15与30 mg/kg组中偶见双头和双尾的精子, 染锰至28 d, 15, 30 mg/kg组精子畸形率明显增加, 与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.01)。染锰至56 d, 各染锰组精子畸形率与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。且随染锰剂量的增加, 精子畸形率升高, 呈明显正相关(r=0.430, P < 0.01)。结果显示精子畸形率随染锰时间的延长而逐渐增高, 亦呈明显正相关(r=0.592, P < 0.01)。

2.3 染锰剂量及时间对小鼠精子活动度的影响(表 3)

随染锰剂量的增加和染锰时间的延长, 活动精子数明显降低, 与剂量和时间呈明显负相关(r=-0.571, P < 0.01; r=-0.381, P < 0.01)。

3 讨论

本实验发现, 随染锰剂量的增加和时间的延长, 各剂量组小鼠精子数量逐渐减少。提示锰可以通过血睾屏障, 干扰生精细胞分裂、分化的过程。研究发现, 锰能使多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)含量减少, 从而降低了DA和5-HT对垂体促性腺激素(LH、FSH)的抑制, 导致FSH和LH水平升高^〔6〕。下丘脑受循环中性激素水平的负反馈调节作用而使睾酮浓度下降。已知精子的生成是一个极其复杂的过程, 有多种因素共同参与调节, 其中睾酮是人们所熟知的一个重要因素^〔7〕。睾酮的主要生理作用之一是促进精子发生, 锰可间接导致睾酮浓度下降, 从而使精子数量减少。锰可抑制乳酸脱氢酶(LDH), 阻碍精子能量来源, 干扰粗线期初级精母细胞的减数分裂及分化为精子的过程, 从而影响精子的数量和活动力^〔8〕。染锰14 d, 30 mg/kg组即出现精子数量的减少, 提示锰可通过血睾屏障, 直接杀伤精子。

本实验结果显示, 染锰28 d, 15, 30 mg/kg组小鼠的精子畸形率均显著高于对照组, 且存在着剂量-效应关系和时间-效应关系。推断染锰4周即可引起精子畸形率增高。目前认为精子形态是由多基因控制。化学物质可使精子头部畸形, 而精子头部损伤又与生殖细胞突变高度相关。研究证实, 锰可导致早期精细胞微核率明显升高, 提示锰具有生殖细胞遗传学效应, 是较强的染色体断裂剂^〔9〕。氯化锰可使生精细胞发生基因突变和染色体畸变, 从而导致小鼠精子畸形率升高。