麻疹是由副粘病毒科麻疹病毒属的麻疹病毒引起的急性传染病^〔1，2〕。研究发现，在麻疹病毒的6个结构基因中，除了血凝素蛋白(H)以外，核蛋白(N)的基因变化较大，其中N蛋白序列的羧基端450个核苷酸的区域属于高变区。为此，我们对麻疹病毒的核蛋白基因的分子生物学进行研究，为预测和控制麻疹的发生提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 标本收集

2004年11月~2005年4月，在吉林省部分地区散发或暴发的麻疹疑似病例中采集标本，患者出疹3 d内同时采集静脉血2 ml (如有可能，出疹7~10 d后再采集1份血)和咽拭子。咽拭子保存在2 ml麻疹病毒标本运输液中(含有5%牛血清和终浓度含青霉素2000 U/ml、链霉素200 μl/ml和制霉菌素25 U/ml的细胞培养液)。用于病毒分离的标本，-80℃保存。

1.2 病毒分离

将标本4℃过夜后取0.5 ml接种于生长良好单层的CDW₁₅₀细胞(又称Vero-SLAM细胞，具有麻疹病毒的细胞受体)，吸附60~120 min后弃取上清，换含2%胎牛血清的胎牛血清培养液(DMEM)，培养7~10 d，每天观察细胞培养液pH值和细胞病变(CPE)。必要时换液或盲传1代。细胞病变 > 75%时收获冻存。

1.3 病毒鉴定

用兔抗麻疹免疫血清对分离株作微量中和试验进行鉴定。兔抗麻疹免疫血清(长春生物制品研究所)。

1.4 麻疹IgM抗体测定

用酶联免疫吸附试验(ELISA)捕捉法检测病人血清中的麻疹IgM抗体，试剂盒(德国维润赛润生物试剂有限公司和北京贝尔生物工程公司)。

1.5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、序列测定和基因分型

采用酚-氯仿抽提液法提取麻疹病毒悬液中的病毒核糖核酸。参照美国疾病预防控制中心引物^〔3〕。每次试验用去离子水作为阴性对照，扩增后的产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。逆转录酶和TaqDNA聚合酶(美国Biolab公司)。扩增后的PCR产物经纯化后，送上海生工生物技术服务有限公司完成测序工作。调出GenBank里的22个基因型代表株N基因羧基端450个碱基对序列，用Bio-Edit软件对这些代表株和本研究所分离到的17个毒株的N基因的450个碱基序列进行对比分析，确定基因分型。

2 结果 2.1 麻疹病毒的分离和鉴定

2004年11月~2005后4月，共收集经血清学确诊为麻疹暴发和散发病例标本103份，在CDW₁₅₀细胞上接种，出现特殊的融合巨细胞病变，并能连续传代的17株(分别编为JL1~17)病毒经微量中和试验鉴定均为麻疹病毒。在79份暴发病例标本中分离到14株麻疹病毒，检出率为17.72%；24份散发病例标本中分离到3株麻疹病毒，检出率为12.5%。

2.2 序列分析和基因分型(图 1)

对17株麻疹病毒进行了序列测定和基因分型，并对N基因羧基端450个核苷酸序列与22个已知基因型参考株的对应序列做基因亲缘性分析，结果均为H₁基因型。H₁基因型是麻疹病毒型内变异最大的基因型。本研究中的17株H₁基因型病毒进一步分为H_1a 13株、H_1b4株。从暴发病例分离的病毒中有11株H_1a亚型和3株H_1b亚型，散发病例分离的病毒中有2株H_1a亚型和1株H_1b亚型。H_1a和H_1b在450个核苷酸片段中的差异为2.05%~4.71%，H_1a亚型内病毒之间变异最大为13个碱基对，而H_1b亚型仅有7个碱基对。

3 讨论

麻疹病毒是单一血清型，一直被认为病毒变异较少、相对稳定。但从20世纪80年代以来，发现一些国家从自然界分离的麻疹病毒的血凝素(HA)蛋白和N基因发生了较大的变异，与经典的Edmonston株比较有差异，与现行的疫苗株有所不同^{〔4, 5〕}。

从标本中分离麻疹病毒由于受诸多条件的影响，成功率不高。通过实验发现，麻疹病毒分离成功与否，除要求生长良好的敏感细胞、保证标本低温运输保存和操作条件外，主要取决于采样时间的早晚。麻疹在发病初期因症状与感冒相似常被忽视，往往在出现皮疹后才做出诊断，但此时机体内已开始产生麻疹的IgM抗体，且滴度迅速上升，使麻疹病毒排毒期在短期内结束。因此，要成功分离出麻疹病毒所使用的标本最好在出疹4d内采集。

1998年WHO发表了依据麻疹病毒的基因特征进行病毒分类及基因型命名的标准，2001年又进行了补充。标准规定对麻疹病毒基因定型至少要对HA全长编码序列或N基因羧基端450个核苷酸序列进行分析，并将麻疹病毒划分为8个基因组(Genetic group)共22个基因型(Genotype)，它们分别是A、B (B_1~3)、C (C₁、C₂)、D (D_1~9)、E、F、G (G_1~3)和H (H₁、H₂)，其中d₁、E、F和G₁已超过10年未发现流行^〔6〕。依据目前全球疾病发生流行趋势，仍将它们列入序列分析的对照株中。通过对已分离的17株麻疹病毒N基因羧基端450个核苷酸序列分析证实，全部是H₁基因型。与相关文献报道的中国麻疹野病毒优势流行株基因型相同^〔7〕。说明H₁基因型是吉林省麻疹病毒的优势流行株，是导致吉林省麻疹局部暴发和散发的主要病原体。