中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (1): 79-81   PDF    
引用本文
陈卡, 糜漫天, 余小平, 许红霞, 周永. 牛磺酸对大鼠视网膜光化学损伤c-fos表达影响[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(1): 79-81.
CHEN Ka, MI Man-tian, YU Xiao-ping, et al. Effects of taurine on c-fos expression of rat retina after photochemical damage[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(1): 79-81.
牛磺酸对大鼠视网膜光化学损伤c-fos表达影响
陈卡, 糜漫天, 余小平, 许红霞, 周永     
第三军医大学预防医学院营养与食品卫生学教研室, 重庆 400038
收稿日期: 2006-04-26
基金项目: 国家自然科学基金(30200228)
作者简介: 陈卡(1979-)女, 四川邻水人, 助教, 硕士, 主要从事营养与视觉生理研究。
摘要: 目的 观察饲料中添加牛磺酸对光化学损伤后大鼠光感受器细胞凋亡的影响, 并进一步从氧化应激基因c-fos表达变化角度探讨其防护机制。 方法 70只SD大鼠随机分为对照组、牛磺酸组。分别喂饲标准饲料或添加4%牛磺酸饲料喂饲15d后接受(3000±200) lx持续0, 1, 3, 6, 9, 12, 24h光照, 凋亡细胞原位末端标记法(TUNEL)检测光感受器细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI); RT-PCR法及免疫印迹法检测视网膜内c-fos mRNA以及蛋白表达水平。 结果 感光细胞凋亡指数随光照时间延长逐渐增加, 牛磺酸组AI显著低于对照组(P < 0.05), 其中光照12h牛磺酸组与对照组AI分别为(12.3±4.7)%和(32.4±6.2)%; 视网膜c-fos mRNA光照1h后一过性表达增高, 牛磺酸组较对照组低(P < 0.05);光照后视网膜c-fos蛋白表达逐渐升高, 于3h达峰值, 牛磺酸组显著低于对照组(P < 0.05)。 结论 在视网膜光化学损伤条件下, 牛磺酸可能通过抑制视网膜c-fos的转录及表达, 阻断光感受器细胞凋亡转导从而保护视网膜。
关键词： 牛磺酸     视网膜光化学损伤     凋亡细胞     c-fos    
Effects of taurine on c-fos expression of rat retina after photochemical damage
CHEN Ka, MI Man-tian, YU Xiao-ping, et al     
Department of Preventive Medicine, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract: Objective To observe the effect of dietary supplementation with taurine on photoreceptorapoptosis and further investigate changes of c-fos expression of rat retina after photochemical damage. Method Seventy rats were randomly divided into control group (Control) and 4% taurine supplementation group (Taurine).The subjects were exposed to (3000±200) lx transmitted by six cold white lights for 0, 1, 3, 6, 9, 12, 24 h.The apoptotic photoreceptor cells were detected using TUNEL method; Total RNA and protein of retina were extracted; relative-cfos mRNA levels were determined using RT-PCR and c-fos protein levels were detected by western-blot analysis. Results With the light exposure time prolonged, apoptosis index (AI) of photo receptor cells was elevated, among which the AI of 12h were (12.3±4.7)% and (32.4±6.2)% in Taurine and control group (P < 0.05).The c-fos mRNA of rat retina was transiently induced after one-hour light exposure and it was lowerin taurine group (P < 0.05);c-fos protein level increased after three hourexposure and it was lower in taurine group (P < 0.05). Conclusion Taurine can partly reduce the transcription and translation of c-fos, which would further inhibit the apoptosis signal transduction and protect the rat retina from photochemical damage.
Key words: taurine     photochemical damage     apoptotic cell     c-fos    

视网膜是视觉形成的重要组织结构, 若光照时间或光照强度等超过视网膜承受力, 则会导致光化学损伤〔1〕, 损伤早期视功能减退, 光感受器细胞丢失, 后期内层神经元变性坏死, 最终导致失明[1.2]。近年研究认为, 凋亡是视网膜光化学损伤中光感受器细胞丢失的主要机制〔1, 3〕, 持续高强度光照使视网膜内自由基和脂质过氧化产物激增, 同时氧化应激基因AP-1表达上调促进凋亡信号转导, 且证实其亚单位c-fos是必需调控因子。牛磺酸与视网膜生长发育和功能维持关系密切, 前期实验已证实, 4%牛磺酸能有效保护光化学损伤条件下的大鼠视网膜〔4〕。本研究拟进一步观察其对光感受器细胞凋亡的影响, 并从c-fos表达变化角度探讨防护机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组

清洁级SD大鼠(第三军医大学第三附属医院动物中心) 70只, 体重150 g左右, 雌雄各半。随机分为对照组、牛磺酸组, 分别喂饲标准饲料或添加4%牛磺酸(北京世纪维他生物技术有限公司, 纯品)饲料15 d后, 各组5只大鼠分别接受(3000±200) lx持续0, 1, 3, 6, 9, 12, 24 h光照。

1.2 凋亡细胞的原位末端标记法(TUNEL)检测光感受器细胞凋亡情况

大鼠光照后立即取出眼球, 4%多聚甲醛固定过夜, 常规石蜡切片, TUNEL试剂盒(德国Roche公司)检测视网膜光感受器细胞凋亡情况参照试剂说明书, 计数10个油镜视野下每张切片TUNEL阳性细胞数, 其与光感受器细胞总数比值为光感受器细胞凋亡指数(AI)。

1.3 视网膜总RNA提取及RT-PCR

大鼠光照后立即取出眼球, 解剖显微镜下小心剥离视网膜, 参考Trizol试剂说明书常规提取总RNA, 核酸蛋白检测仪测定其含量与纯度。-20℃保存备用。RT-PCR按照逆转录试剂盒说明书进行, 以大鼠β-actin为内参, 上游引物序列为5'-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3', 下游引物序列为5'-GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3', 退火温度为55.4℃, 产物长度为684 bp; c-fos上游引物序列为5'-GCCTTTCCTACTACCATTCC-3', 下游引物序列为5'-ATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3', 退火温度为53.3℃, 产物长度为370 bp。扩增条件为94℃ 5 min 40 s, 各退火温度45 s, 循环32次, 72℃ 10 min。2%琼脂糖凝胶电泳, Bio-Rad凝胶成像分析系统扫描以及分析。PCR特异条带以相对吸光度×面积(mm2)表示, 以各组的校正吸光度与其β-actin校正吸光度的比值表示(V)。

1.4 免疫印迹法测定视网膜c-fos蛋白表达情况

大鼠光照后立即取出眼球, 剥离视网膜, 常规方法提取总蛋白, Lowry法定量。总蛋白(40Lg)经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (5%积层胶、12%分离胶)后, 采用Bio-Rad半干转印仪将凝胶中的蛋白转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜, 利用c-fos多克隆抗体(1:150稀释, 北京中杉生物制剂公司)检测膜上蛋白。Bio-Rad凝胶成像分析系统分析相对表达量, 以0 h组蛋白表达量为内参, 其他各个时相点灰度值与内参比值为相对灰度值(A)。

1.5 统计分析

采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。

2 结果 2.1 牛磺酸对光照后大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响

对照组光照6h后, 发现棕褐色TUNEL阳性细胞散在分布于外核层(ONL)内部, 即受损的多为视杆细胞, 而牛磺酸组光照9h后才开始出现阳性细胞, 随光照时间延长, 阳性感光细胞增多, 光照24h后视网膜内核层、节细胞层也出现大量阳性细胞(图 1)。光化学损伤后AI随光照时间延长逐渐增高, 牛磺酸组光照12 h AI值(12.3±4.7)%显著低于对照组(32.4±6.2)%, 其他时相点也显著低于对照组(P < 0.05)。

A:对照组, 光照0h; B:对照组, 光照9h; C:牛磺酸组, 光照9 h 图 1 牛磺酸对光化学损伤后大鼠视网膜光感受器凋亡的影响(TUNEL, ×400)

2.2 牛磺酸对光照后大鼠视网膜c-fos转录以及表达的影响 2.2.1 牛磺酸对光照后大鼠视网膜c-fos mRNA表达的影响

光照后对照组和牛磺酸组大鼠视网膜c-fos mRNA表达均出现一过性增高, 且在光照1 h达到峰值, 随着光照时间延长其表达逐渐降低, 于6 h光照后其表达量接近未光照水平(图 2)。利用灰度扫描计算V值发现, 光照1 h时牛磺酸组大鼠视网膜c-fos mRNA较对照组表达低(P < 0.05)。

D:对照组; T :牛磺酸组 图 2 不同光照时间对大鼠视网膜c-fos mRNA表达的影响

2.2.2 牛磺酸对光照后大鼠视网膜c-fos蛋白表达的影响

光照后2组动物视网膜c-fos蛋白表达逐渐增高, 于光照3 h达到峰值, 随光照时间延长其表达量逐渐降低, 光照12 h其表达量接近未光照时水平(图 3)。A分析提示牛磺酸组3 h蛋白表达相对量比对照组低(P < 0.05)。

D:对照组; T :牛磺酸组 图 3 不同光照时间对大鼠视网膜中c-fos蛋白表达的影响

3 讨论

视网膜光化学损伤后光感受器细胞丢失的机制尚存在一定的争议, 但大部分研究者认为, 凋亡是光化学损伤以及其他视网膜变性疾病光感受器细胞丢失的主要机制〔3, 5〕。本研究在前阶段证实, 4%牛磺酸能有效保护持续高强度光照[(3000±20) lx, 24h]条件下大鼠视网膜基础上, 结合凋亡细胞生化特征, 采用TUNEL法检测凋亡细胞。实验结果提示, 牛磺酸减少了光照不同时相点凋亡指数, 与其他研究报道〔6, 7〕牛磺酸具有抗神经元凋亡作用相符。近年研究发现, AP-1是调控光感受器细胞凋亡的重要影响因子, 其亚基c-fos是必需的调控因子〔3, 8〕。AP-1参与了许多生理过程如细胞增殖、分化、死亡及恶性转化等, 脂多糖、氧化应激、紫外线等均能增加其活性, 并通过调节靶基因转录发挥作用〔7〕, 其中, c-jun/c-fos二聚体形式的AP-1复合物生物活性最强〔6〕。光损伤条件下cfos (-/-)大鼠光感受器细胞几乎未丢失, 以及大鼠、小鼠和661W光感受器细胞短期光照后c-fosmRNA表达一过性增高, 均说明c-fos在光诱导光感受器细胞凋亡中促进凋亡作用〔3-8〕。本研究发现, 牛磺酸组c-fos mRNA以及蛋白表达峰值均比对照组低, 推测牛磺酸可能通过抑制c-fos表达, 导致整个AP-1复合物减少, 阻断凋亡信号转导, 从而有效保护光感受器细胞。文献报道, Tau-Cl能降低FLS细胞AP-1活性, 而牛磺酸不能〔9〕。因此, 牛磺酸可能通过捕捉次氯酸(HOCI)形成Tau-C1, Tau-Cl才是牛磺酸的活性形式, 上述推论还需进一步证实。

参考文献
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