中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (1): 75-77   PDF    
引用本文
冯永亮, 王素萍, 史晓红, 魏俊妮, 赵小嘉, 安珊珊, 陈晓, 麻春林, 张昌琳. 人类白细胞抗原等位基因与HBV宫内感染关系[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(1): 75-77.
FENG Yong-liang, WANG Su-ping, SHI Xiaohong, et al. Association between HLA-DR alleles and HBV intrauterine infection[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(1): 75-77.
人类白细胞抗原等位基因与HBV宫内感染关系
冯永亮1, 王素萍1, 史晓红1, 魏俊妮1, 赵小嘉2, 安珊珊2, 陈晓2, 麻春林2, 张昌琳2     
1. 山西医科大学流行病学教研室, 太原 030001;
2. 山西医科大学
收稿日期: 2006-04-19
基金项目: 国家自然科学基金(30070699);山西医科大学学生创新基金项目
作者简介: 冯永亮(1978-), 男, 山西人, 硕士, 助教, 研究方向:传染病分子流行病学。
通讯作者: 王素萍
摘要: 目的 研究人类白细胞抗原(HLA)-DR3、DR7、DR13、DR53等位基因与乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus, HBV)宫内感染的关系, 探讨HBV宫内感染的遗传易感性, 确定HBV宫内感染的易感基因和保护基因。 方法 采用聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR-SSP)技术检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿各187例外周静脉血血块中HLA-DR3、DR7、DRl3、DR53等位基因型分布及频率。 结果 (1)宫内感染组孕妇HLA-DR3基因频率为24.14%(7/29), 显著高于非宫内感染组孕妇的6.33%(10/158)(P=0.007)。其余各表型比较, 差异无统计学意义(P > 0.05)。(2)宫内感染组新生儿HLA-DR3基因频率为17.24%(5/29), 显著高于非宫内感染组新生儿的5.06%(8/158)(P=0.033)。其余各表型比较, 差异无统计学意义(P > 0.05)。(3)母婴HLA-DR3同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较差异有统计学意义(P=0.049);母婴HLA-DR7、DR13、DR53同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较, 差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 HBsAg阳性孕妇及其胎儿同时或任一携带HLA-DR3, 易导致HBV宫内感染; HLA-DR3是HBV宫内感染的易感基因。
关键词： 乙型肝炎病毒     宫内感染     人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)    
Association between HLA-DR alleles and HBV intrauterine infection
FENG Yong-liang, WANG Su-ping, SHI Xiaohong, et al     
Department of Epidemiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract: Objective To study the association between HLA-DR3, DR7, DR13, DR53 and HBV intrauterine infection to probe into the susceptibility to intrauterine infection of hepatitis Bvirus and to find its predisposing genes and protecting genes. Method HLA-DR3, DR7, DR13, DR53 were detected by the technique of poly merase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) in maternal and neonatal blood clot.Results (1) The frequency of HLA-DR was 24.14% in women with intrauterine infection, which was higher than that (6.33%) in women without intrauterine infection (P=0.007).There was no association between HLA-DR7, DR 13, DR53 positive in pregnant women and HBVintr auterine infection (P > 0.05).(2) The frequeney of HLA-R of new borns was 17.24% in women with intrauterine infection, which is higher that (5.06%) in women withotll infection (P=0.033).There was no association between HLA-DR7, DR13, DR53 positive in new borns and HBVintrauterine infection (P > 0.05).(3) There was significant association between HLA-DR3 concordance and HBV intrauterine infection (P=0.049).There was no association between DR7, DR13, DR53 conco rdance and HBV intrauterine infection (P > 0.05). Conclusion HLA-DR3 carriers of pregnant women and their new borns have susceptibility to HBV intrauterine infection.HLA-DR3 is the predisposing gene of HBV intrauterine infection.
Key words: HBV     intrauterine infection     HLA-DR antigen    

肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病, 我国是乙肝高发区, 乙肝病毒的母婴传播不仅造成人群中众多的HBsAg携带者, 而且是引起成人慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的重要因素。迄今, 多数学者认为, 人类白细胞抗原DR等位基因(HLA-DR)与乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相关, 而HLA-DR等位基因与HBV宫内感染的关系争议较多。本文通过研究HLA-DR3、DR7、DR13、DR53与HBV宫内感染的关系, 探讨HBV宫内感染的遗传易感性, 为防制HBV宫内感染提供理论依据。

1 对象与方法 1.1 对象

以2003年6月~2004年11月太原市省各市级医院筛检, 并在太原市传染病院妇产科进行产前检查及分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿各187例作为研究对象。并根据新生儿有无宫内感染, 分为宫内感染组(29例)和宫内未感染组(158例), 2组在年龄分布、文化程度、职业构成等均衡可比。

1.2 方法 1.2.1 标本采集及处理

收集孕妇肘静脉血及新生儿出生24h内且未注射高效价免疫球蛋白(HBIG, hepatitis Bimmune globulin)的股静脉血各2 ml, 4℃冰箱保存, 6 h内以4000 r/ min 4℃离心15 min, 分离血清与血块, -20℃保存备检。

1.2.2 乙肝血清标志物检测

采用酶联免疫吸附(ELISA)法, 试剂盒(上海科华实业总公司)。

1.2.3 HBV DNA检测

(1) HBV DNA提取:参考文献〔1〕, 采用异硫氰酸胍一步法提取血清DNA; (2) HBV DNA的扩增:采用巢式聚合酶链反应(nPCR)。

1.2.4 HLA-DR等位基因检测

(1)人类基因组DNA的提取十二烷基磺酸钠(SDS)蛋自酶K法提取血块基因组DNA。(2) HLA-DR等位基因扩增:参考文献〔2〕的引物设计采用聚合酶链反应/序列特异性引物(PCR-SSP)技术检测孕妇及其新生儿外周静脉血血块中HLA-DR3、DR7、DR13、R53基因型分布及频率。(3) PCR产物的检测:取扩增产物5~10 μl, 按5:1(V:V)与溴酚兰混匀, 加样于1.5%琼脂糖凝胶(含015 Lg/ml溴化乙锭)板, 在60 V/cm电压下泳动50 min, 紫外灯下观察结果。

1.2.5 新生儿HBV宫内感染诊断标准

新生儿外周血血清HBsAg和/或HBVDNA阳性, 即诊断为HBV宫内感染。

1.3 统计分析

资料输入SPSS 11.5软件进行统计分析; 计算各指标的阳性率, 四格表χ2、Fisher确切概率、OR值及OR95%CI。

2 结果 2.1 HBsAg阳性孕妇及其新生儿HLA-DR扩增图谱

提取的血块DNA经PCR扩增后呈现明显条带, 与标准分子标记物(Marker)条带比较, 确定HLA-DR基因型(图 1, 2, 3, 4)。

DR3+ : HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR3阳性扩增产物, 扩增产物片断长度为151bp; DR3-: HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR3阴性扩增产物; M:标准分子标记物(Marker) 图 1 HLA-DR3等位基因的PCR扩增产物电泳结果

DR7+:HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR7阳性扩增产物, 扩增产物片断长度为232bp; DRT-:HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR7阴性扩增产物; M:标准分子标记物(Marker) 图 2 HLA-DR7等位基因的PCR扩增产物电泳结果

DR13+:HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR13阳性扩增产物, 扩增产物片断长度为130bp; DR13-:H BsAg阳性孕妇或其新生儿DR13阴性扩增产物; M:标准分子标记物(Marker) 图 3 HLA-DR13等位基因的PCR扩增产物电泳结果

DR53+ : HBsAg阳性孕妇或其新生儿DR53阳性扩增产物, 扩增产物片断长度为213bp; DR53-: H BsAg阳性孕妇或其新生儿DR53阴性扩增产物; C:内对照
注: DR53引物与内对照引物可能发生了引物间的错配等, 故分管同时扩增 图 4 HLA-DR53等位基因的PCR扩增产物电泳结果

2.2 HLA-DR与HBV宫内感染的关系 2.2.1 孕妇HLA-DR等位基因分布及频率比较(表 1)
表 1 宫内感染组与宫内未感染组孕妇HLA-DR基因分布及频率比较

宫内感染组孕妇HLA-DR3基因频率明显高于宫内未感染组, 经检验, 差异有统计学意义(OR=41709, P=01007); HLA -DR7、DR13、DR53基因频率在宫内感染组与内未感染组孕妇比较, 经检验, 差异无统计学意义(P > 0.05)。

2.2.2 新生儿HLA-DR等位基因分布及频率比较(表 2)
表 2 宫内感染组与宫内未感染组新生儿HLA-DR基因分布及频率比较

宫内感染组新生儿HLA-DR3基因频率明显高于宫内未感染组, 经检验, 差异有统计学意义(OR=3.906, P=0.033); HLA-DR7、DR13、DR53基因频率在宫内感染组与宫内未感染组新生儿比较, 经检验, 差异无统计学意义(P > 0.05)。

2.2.3 母婴HLA-DR等位基因同阳性分布及频率比较(表 3)
表 3 宫内感染组与宫内未感染组母婴HLA-DR同阳性分布及频率比较

母婴HLA-DR3同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较, 经检验, 差异有统计学意义(OR=5.96, P=0.049), 母婴HLA-DR7、DR13、DR53同阳性在宫内感染组与宫内未感染组间比较, 经验验, 差异无统计学意义(P > 0.05)。

3 讨论

KilpatrickDC〔3〕的研究发现, HLA-A是人类免疫缺陷病毒(HIV)宫内感染的保护基因, HLA-DR3是HIV宫内感染的易感基因。BosiL等〔4〕采用Logistic回归分析发现, HLA-DR13与发生HCV宫内感染呈负相关, 即HLA-DR13是HCV宫内感染的保护因素。在母亲同时感染HIV者中, HLA-DR13和HIV同时感染在HCV宫内感染的发生中具有独立而相反的作用, 即HLA-DR13是HCV宫内感染的保护因素; HLA-DR13表达在未发生HCV, 宫内感染和发生了HCV宫内感染者的OR值为814(95% CI=1.1~60.8), 且母乳喂养不影响该HCV宫内感染的危险度。

王素萍等〔5〕以HBsAg阳性孕妇新生儿为研究对象, 随机选择发生及未发生HBV宫内感染的新生儿各20例, 应用试剂盒提供的序列特异性引物(sequence specific primers, SSP)采用PCR-SSP技术扩增HLA-DR基因区18对等位基因, 判定HLA-DR抗原的型别, 计算HLA-DR抗原各型别出现频率并分析其在2组间的差别, 发现DR3、DR51在宫内感染组的频率较高, 分别为45%, 40%。在非宫内感染组分别为20%, 15%, P值分别为0.18, 0.16。DR53在非宫内感染组的频率较高, 为60%, 在宫内感染组为35%。推测HLADR3、DR51可能是HBV宫内感染的易感型, 而DR53有可能是具有保护作用型别。刘海英等〔6〕采用PCR-SSP法合成相应的特异性引物序列, 对HLA-DR3、DR4、DR13、DR15进行研究。结果显示, 宫内感染组孕妇HLA-DR3的基因频率为50%, 显著高于宫内未感染组的14.7% (RR=5.8, χ2=4.90, P < 0.05), 其余各基因表型比较, 差异无统计学意义; 宫内感染组新生儿HLA-DR3的基因频率为30%, 明显高于宫内未感染组的7.4%, 但差异无统计学意义(P > 0.05), 提示孕妇或胎儿携带HLA-DR3, 易导致HBV宫内感染, 即孕妇或胎儿HLA-DR3阳性是HBV宫内感染的易感基因。

本文同样采用PCR-SSP技术研究HLA-DR特异性等位基因与HBV宫内感染的关系。结果表明, HBsAg阳性孕妇及其胎儿同时或任一携带HLA-DR3, 易导致HBV宫内感染; HLA-DR3是HBV宫内感染的易感基因。提示在防制HBV宫内感染时不能忽视人类遗传因素的作用, 应采取综合措施防制HBV宫内感染。

参考文献
[1] 向海平, 郭雁宾, 孟庆华, 等. 聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒DNA及其临床意义分析[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 1999, 13(1) : 89–90.
[2] Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence specific primers (PCR-SSP) in 2 hours:an alternativa to serological DR typing in clinical practice in cluding donorrecipient matching in cadaveric transplantation[J]. Tissue Antigens, 1992, 39 : 225–229. DOI:10.1111/tan.1992.39.issue-5
[3] Kilpatrick DC, Hague RA, Yap PL, et al. HLA antigen frequencies in children born to HIV-infected mothers[J]. Dis Markers, 1991, 9(1) : 21–26.
[4] Bosi I, Ancora G, Mantovani W, et al. HLA-DR13 and HCV vertical infection[J]. Pediatr Res, 2002, 51(6) : 746–749. DOI:10.1203/00006450-200206000-00014
[5] 王素萍, 孔宪毅, 薛淑莲, 等. HLA-DR抗原与HBV宫内感染关系研究[J]. 中国公共卫生, 2003, 19(7) : 772–774.
[6] 刘海英, 孔北华, 罗霞, 等. 乙型肝炎病毒母婴垂直传播与人类白细胞抗原DR区域基因相关性的研究[J]. 中华妇产科杂志, 2003, 38(10) : 599–603.