遗传因素在冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病CHD)发病中具有重要作用, 但早发与迟发病例在遗传背景方面存在较大差异, 其中, 内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因对冠心病具有重要作用^〔1〕。eNOS基因内含子4存在27 bp的可变串联重复序列(VNTR), 研究显示, 这种多态性与机体一氧化氮(NO)的代谢水平密切相关^〔2〕。为探讨eNOS基因内含子4VNTR多态性与早发冠心病之间的关系, 本文对188例早发冠心病及315例迟发冠心病进行观察比较。结果报告如下。

选择2002年6月~2005年6月山东大学附属医院心内科确诊的新发病例503例, 均符合1979年WHO制定的关于缺血性心脏病的诊断标准^〔3〕, 以男性≤55岁及女性≤65岁患有冠心病者为早发冠心病。以早发冠心病188例为观察组, 平均年龄(51.1±7.76)岁; 迟发冠心病315例为对照组, 平均年龄(69.7±8.02)岁。

(1)问卷调查:内容包括年龄、性别、既往病史、吸烟史和饮酒史; 体检包括身高、体重、腰围、臀围、收缩压(SBP)和舒张压(DBP); 并按体重/身高²(kg/m²)计算体质指数(BMI), 按腰围/臀围计算腰臀比(WHR)。(2)采集血样:抽取调查对象空腹肘静脉血5 ml, 其中1 ml用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)-Na抗凝, 用于基因组DNA提取; 4 ml分离血清, 用于血清学检测。(3)血清生化指标检测:血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)用酶法测定, 试剂盒由(北京中生生物工程高技术公司。)

用十二烷基硫酸钠(SDS)及蛋白酶K消化, 酚/氯仿提纯, 乙醇沉淀。

以提取的DNA为模板, 根据设计的上、下游引物, 用P CR方法特异性扩增含有可变串联重复序列的片段。引物序列, 上游5'-CTCAGCCCAGTAGTGAAGAC-3';下游5'-GCTTCTCTTAGTGCTGTGGT-3'。PCR反应体系总体积为30 μl, 其中含模板100 ng, 引物各0.3 Lmol/L, 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl₂, 10 mmol/L Tris-HCl (pH=8.4), 0.15 mmol/L dNTPs, 115 U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。反应条件为95 ℃预变性5 min, 33个循环中95 ℃变性45 s, 58 ℃退火60 s, 72 ℃延伸45 s, 最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用8%的聚苯烯酰胺电泳, 银染色观察实验结果。根据片段数量与长度进行基因型分析。

用SPSS 1.15及STATA 8.2软件进行分析, 计数资料用χ²检验; 计量资料用两样本均数比较的t检验; 多因素分析用多元逐步非条件Logistic回归。

(1)早发冠心病组男性104例, 女性84例, 性别比为1.24:1;迟发冠心病组男性221例, 女性94例, 性别比为2.35:1。早发冠心病组吸烟者73例, 吸烟率为38.8%;迟发冠心病组吸烟者92例, 吸烟率为29.2%。早发冠心病组饮酒者44例, 饮酒率为23.4%;迟发冠心病组饮酒者45例, 饮酒率为14.3%。其中性别比、吸烟率、饮酒率等差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。(2)2组检测指标比较:早发冠心病组收缩压/舒张压分别为(127.47±18.10)/ (79.22±11.00) mmHg; 迟发冠心病组为(131.51±23.39)/ (77.59±12.84) mmHg。早发冠心病组体质指数为(26.32±31.6) kg/m², 迟发冠心病组为(24.96±3.69) kg/m²。早发冠心病组腰臀比为0.90±0.07, 迟发冠心病组为0.88±0.07。早发冠心病组血清甘油三酯为(2.02±1.32) mmol/L, 迟发冠心病组为(1.56±0.94) mmol/L。早发冠心病组胆固醇含量为(5.39±1.11) mmol/L, 迟发冠心病组为(5.17±1.16) mmol/L。2组的收缩压、体质指数、腰臀比、血清甘油三酯和胆固醇含量等差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。

表 1

表 1 eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病关系的多元Logistic回归分析

表 1 eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病关系的多元Logistic回归分析

(1)将eNOS基因内含子4的VNTR多态性按不同等位基因分析, 4次串联重复序列等位基因记为eNOS4a;5次串联重复序列野生型等位基因记为eNOS4b;6次串联重复序列等位基因记为eNOS4c。PCR结果显示, 共扩增出5种基因型, 其中:a/a片段长度为425 bp; b/a 2个片段长度分别为452和425 bp; b/b片段长度为452 bp; c/b 2个片段长度分别为479和452 bp; c/c片段长度为479 bp。(2)为观察eNOS4a基因型与冠心病的相关性, 将eNOS4a与eNOS4b及eNOS4c进行基因型与等位基因频率分析。结果可见, c/c+c/b+b/b (合并后的频数与频率, 早发冠心病组为154与81.91%;迟发冠心病组为245与77.78%), 与b/a+a/a (合并后的频数与频率, 早发冠心病组为34与18.09%;迟发冠心病组为70与22.22%), 经比较, χ²=1.229, P=0.268, OR=1.294, 95% CI=0.820~2.043;c+b (合并后的频数与频率, 早发冠心病组为339与90.16%;迟发冠心病组为554与87.94%)与a (频数与频率, 早发冠心病组为37与9.84%;迟发冠心病组为76与12.06%), 经比较, χ²=1.167, P=0.280, OR=1.257, 95% CI=0.830~1.904, 差异均无统计学意义。

表 2

表 2 eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病关系的多元Logistic回归分析

表 2 eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病关系的多元Logistic回归分析

在α=0.05显著性水平上, 用多元逐步非条件Log istic回归筛选性别、吸烟、饮酒、收缩压、BMI、WHR、甘油三酯、总胆固醇等有显著影响的可能混杂因素, 并将eNOS基因内含子4 VNTR纳入模型, 以探讨在控制可能的混杂因素后eNOS基因内含子4 VNTR多态性的效应。表 2可见, eNOS基因内含子4 VNTR多态性与早发冠心病无显著性相关。

目前, 虽然国内外对eNOS4a/b VNTR多态性与冠心病之间的关系研究较多, 但结果相差甚远。有资料认为^{〔4, 5〕}, eNOS4a等位基因能显著升高冠心病的发病危险性。有研究表明^〔6〕, eNOS4a/b VNTR多态性与冠心病无显著性相关, 但有资料显示^〔7〕, eNOS4a等位基因对冠心病的发病具有显著的保护性作用。尽管导致现有资料结果相互矛盾的原因众多, 但各研究所选研究对象年龄的不同可能是其原因之一, 因为早发冠心病与迟发冠心病在遗传背景方面存在巨大差异。Lee等研究显示^〔5〕, 只有在年龄 < 51岁的人群中, eNOS4a/b VNTR多态性与冠心病之间的关系才具有显著性。本研究结果显示, 无论单因素分析还是多因素分析调整潜在的混杂因素后, eNOS4a/b VNTR多态性与早发冠心病之间均无显著性相关。唐欧杉等^〔8〕选择年龄匹配的健康者作为对照组, 结果显示, eNOS4a/b VNTR多态性与早发冠心病之间也无显著性相关, 与本研究结果一致。

关于eNOS4a/b VNTR多态性是否引起eNOS的功能改变目前尚无定论。虽然有资料显示^〔2〕, eNOS4a基因携带者血浆NO水平显著降低, 但是eNOS4a等位基因与eNOS基因T-786C变异存在显著的连锁不平衡^〔9〕, 而eNOS基因T-786C变异能显著降低eNOS基因启动子活性^〔10〕。因此, 关于eNOS4a/b VNTR多态性仅仅是一个遗传标记, 还是与冠心病发生相关的因素, 以及其与冠心病之间的关系如何尚须进一步深入研究。