中国公共卫生  2018, Vol. 34 Issue (1): 93-96   PDF    
引用本文
田亭, 凡豪志, 黄鹏, 陈明珠, 王洁, 李军, 张云, 岳明. HCV基因型和rs11820062对丙型肝炎感染转归影响[J]. 中国公共卫生, 2018, 34(1): 93-96.
TIAN Ting, FAN Hao-zhi, HUANG Peng, et al. Effects of HCV genotypes and V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A rs11820062 on outcome of HCV infected patients[J]. Chinese Journal of Public Health, 2018, 34(1): 93-96.
HCV基因型和rs11820062对丙型肝炎感染转归影响
田亭1, 凡豪志1, 黄鹏1, 陈明珠1, 王洁2, 李军3, 张云1,4, 岳明3    
1. 南京医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，江苏 南京 211166;
2. 南京医科大学护理学院护理学基础系;
3. 南京医科大学第一附属医院感染科;
4. 南京军区军事医学研究所
收稿日期: 2017-02-03; 数字出版日期: 2017-5-25.
基金项目: 国家自然科学基金（81502853），江苏省自然科学基金（BK20151026），江苏省卫计委“科教强卫工程”青年医学人才项目（QNRC2016616）
作者简介: 田亭(1991 – )，男，江苏泰州人，硕士在读，研究方向：传染病流行病学。
通讯作者: 张云，E-mail：zhangyunvip@126.com; 岳明，E-mail：njym08@163.com
摘要：目的 探索丙型肝炎病毒（HCV）基因型和核转录因子-κB（NF-κB）家族V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）基因上rs11820062位点对丙型肝炎患者感染转归影响。方法 于2008年10月—2015年5月共收集788例丙肝感染者（其中有271例自限清除者和517例持续感染者），通过TaqMan-MGB探针法对788例丙肝患者的RELA基因上rs11820062位点基因分型，以Simmonds法对所有患者HCV基因型进行检测。用单因素和多因素logistic回归分析丙肝感染转归的高危因素。结果 271例HCV自限清除者中，HCV 1b型为146例（53.9 %），非1b型为80例（29.5 %），混合型为45例（16.6 %）；517例持续感染者中，HCV 1b型为234例（45.3 %），非1b型为48例（9.3 %），混合型为235例（45.4 %）。单因素logistic回归分析结果显示，HCV基因型和HCV感染慢性化之间存在关联；多因素logistic回归分析结果显示，与HCV非1b基因型相比，1b型（OR = 2.650，95 % CI = 1.631～4.307）和混合型（OR =3 .159，95 % CI = 1.751～5.699）更易发展为慢性感染。在隐性模型中，携带有rs11820062 TT基因型（OR = 1.689，95 % CI = 1.090～2.617）的患者存在慢性感染倾向。交互作用分析表明，HCV基因型和rs11820062之间对HCV感染慢性化的影响相互独立（P = 0.280）。结论 携带NF-κB家族rs11820062 TT基因型的丙肝感染者更易进展为慢性丙肝，且HCV基因型和rs11820062对HCV慢性化影响相互独立。
关键词：丙型肝炎病毒（HCV）     核转录因子-κB（NF-κB）     遗传变异     基因型     感染结局    
Effects of HCV genotypes and V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A rs11820062 on outcome of HCV infected patients
TIAN Ting, FAN Hao-zhi, HUANG Peng, et al     
Department of Epidemiology and Health Statistics, School of Public Health, Nanjing Medical University, Nanjing, Jiangsu Province 211166, China
Abstract: Objective To explore effects of genotype of hepatitis C virus (HCV) and rs11820062 of V-Rel reticu-loendotheliosis viral oncogene homolog A (RELA) of nuclear factor-kappa B (NF-κB) family genes on the outcome of HCV infection. Methods The HCV genotypes of 788 patients were genotyped with PCR products of 5' untranslated region (UTR) digested with restriction endonucleases. The rs11820062 was genotyped with TaqMan assay among the 788 HCV infected patients, including 271 spontaneous viral clearance subjects and 517 persistent HCV-infected subjects. Univariate and multivariate logistic regression analysis were used to analyze the association of relevant factors with HCV infection outcome. Results Of the 271 spontaneous viral clearance participants, 146 (53.9 %), 80 (29.5 %), and 45 (16.6 %) were identified with the HCV genotype of 1b, non-1b, and the mixed; of the 517 persistent HCV-infected participants, 234 (45.3 %), 48 (9.3 %), and 235 (45.4 %) were identified with the HCV genotype of 1b, non-1b, and the mixed. Univariate logistic regression analysis showed that HCV genotype was correlated with the chronicity of HCV infection. The results of multivariage logistic regression analysis showed that the participants with the HCV infection of 1b (odds ratio [OR] = 2.650, 95 % confidence interval [95 % CI]: 1.631 – 4.307) or the mixed genotype ( OR = 3.159, 95 % CI: 1.751 – 5.699) were more likely to have chronic HCV infection compared to those with the HCV infection of non-1b genotype. Based on a recessive model, the participants carrying TT genotype of rs11820062 were prone to develop chronic HCV infection. Interactive analysisshowed that the effects of HCV genotype and rs11820082 on the outcome of HCV infection are independent ( P = 0.280). Conclusion The HCV infected individuals with TT genotype of rs11820082 of NF-κB family genes are prone to develop chronic HCV infection and the effects of HCV genotype and genotype of rs11820082 on the chronicity of HCV infection are self-independent.
Key words: hepatitis C virus     nuclear factor-kappa B     genetic variation     genotype     infection outcome    

数据显示，1990 — 2005年间全球丙型肝炎患病率从2.3 % 上升到2.8 % [1–2]。丙肝感染者中有相当一部分患者未能清除病毒，导致感染的慢性化，甚至可能进展为肝硬化和肝细胞肝癌[3–4]。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA基因组突变率较高，由于其亚种的异质性，导致极易发生免疫逃逸现象，从而发生慢性化感染[5]。在HCV流行病学研究中，HCV基因型也具有重要意义[6]。核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是一种蛋白复合物，可以和特定的核苷酸序列结合，从而控制DNA的转录过程并调节免疫应答[7–8]。研究表明，编码NF-κB的NF-κB家族基因的单核苷酸多态性和许多疾病相关，位于NF-κB1启动子区域上的rs28362491与肝细胞肝癌显著相关[9]。在多发性骨髓瘤病人中，携带rs1056890 CT+TT基因型意味着较高的存活率[10]。因此，NF-κB家族基因的变异可能影响HCV的感染结局。人类NF-κB家族基因由NF-κB1、NF-κB2、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（V-Rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA）、RELB和REL组成[7]。本研究通过检测NF-κB家族RELA基因上的rs11820062位点，探索HCV基因型与HCV感染慢性化的关系。结果报告如下。

1 对象与方法 1.1 对象

为2008年10月 — 2015年5月期间收集的788例丙型肝炎患者，包括185例血液透析者，311例吸毒者，以及292例有偿献血者。将788例病人分为自限清除组和持续感染组，其中自限清除组271例，持续感染组517例。自限清除组定义为抗-HCV血清学阳性和HCV RNA阴性，持续感染组定义为抗-HCV血清学阳性和HCV RNA阳性。所有血清学结果均是基于6个月的随访所确定的。

1.2 主要仪器与试剂

ABI 7900荧光定量PCR仪、ABI 9700 PCR扩增仪（美国Applied Biosystems公司），DYCP-32C型琼脂糖水平电泳仪（南京科宝仪器研究所）。丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒（山东莱博公司），Trizol LS试剂盒（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（日本Takara公司），rs11820062引物和探针由南京骥骜生物技术有限公司设计。

1.3 指标与方法 1.3.1 流行病学调查

采用结构化问卷，由经过统一培训的调查员对每位参与者进行问卷调查，收集人口数据资料和相关的环境暴露因素；保证数据的完整性和准确性，调查后采集每位参与者10 mL静脉血。5 mL血样用于HCV检测和分型、乙肝5项及肝功能生化指标谷丙转氨酶（alanine amiotrans-ferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）检测，5 mL血样用于基因组DNA提取。

1.3.2 生化指标检测

血清中ALT、AST含量检测采用试剂盒法，委托南京医科大学第一附属医院进行检测。

1.3.3 病毒检测和分型

HCV RNA用Trizol LS试剂盒提取，按说明书操作。取上述RNA 5 μL进行PCR扩增，逆转录合成cDNA；使用Simmonds分型法[11]，用5' NCR 1、2、3和1b型特异性引物对上述获得的cDNA进行扩增，获得各型不同产物，利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，得到HCV基因型；HCV基因型分为1b型、非1b型以及混合型。

1.3.4 基因多态性位点筛选

从HapMap数据库、NCBI dbSNP数据库及相关文献中进行NF-κB家族基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点筛选，要求SNP在汉族人群中的最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）>5%，最终rs11820062被纳入本次研究。

1.3.5 基因分型

应用TaqMan探针实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术对rs11820062位点进行基因分型；PCR反应体系总量为5 μL，40个循环。PCR反应后在PCR仪上读取荧光信号。rs11820062引物序列：上游5′-CTTGACTCAGTTTCCCTCCACAC-3′，下游5′-GAGGGAAAACGGGGTAAGGAATC-3′。

1.4 统计分析

使用Epi Data 3.10建立数据库，应用SPSS 20.0软件进行相关统计分析。计数资料组间比较采用 χ2 检验，计量资料组间比较采用Mann-Whitney U 检验；HCV和rs11820062基因型与丙型肝炎感染结局的关联性采用logistic回归分析，检验水准为α = 0.05。

2 结　果 2.1 一般情况（表1）

788例丙型肝炎患者中自限清除组和持续感染组的年龄、性别和感染途径分布差异均有统计学意义（P < 0.001）；自限清除组和持续感染组ALT水平（分别为23.0、34.0 U/L）、AST水平（分别为24.0、32.5 U/L）差异有统计学意义（ P < 0.001）。自限清除者与持续感染者之间的HCV基因型分布差异有统计学意义（ χ2 = 89.204，P < 0.001）。

表 1 研究对象一般特征

2.2 HCV基因型和丙型肝炎感染转归关联分析（表2）

单因素logistic回归分析表明，HCV基因型是丙型肝炎感染慢性化的危险因素（P < 0.001）；纳入性别、年龄、感染途径、ALT和AST等协变量后的多因素logistic回归分析结果显示，与HCV非1b基因型比较，1b基因型（ OR = 2.650，95 % CI = 1.631～4.307）和混合基因型（OR = 3.159，95 % CI = 1.751～5.699）更易发展为慢性感染。

表 2 丙型肝炎转归影响因素logistic回归分析

2.3 rs11820062和HCV感染转归关联分析（表3）

采用相加模型、显性模型和隐性模型分别对rs11820062在HCV感染转归上作用进行分析，结果显示，在隐性模型中，携带rs11820062 TT基因型的患者易发生HCV慢性化感染（OR =1.689，95 % CI = 1.090～2.617）。

表 3 rs11820062基因型在不同组别中的分布

2.4 HCV和rs11820062基因型对丙型肝炎感染慢性化影响的交互作用分析

作为病毒因素的HCV基因型和作为宿主遗传因素的rs11820062基因型均和丙型肝炎感染慢性化之间存在关联，纳入年龄、性别、感染途径、ALT和AST为协变量的交互作用分析显示，HCV和rs11820062基因型的乘积项无统计学意义（P=0.280），将HCV基因型转换为（1b型 + 混合型 : 非1b型），将rs11820062转换为（CC + CT : TT）的二分类变量，分层分析后进行异质性检验，I2 = 0.00，无异质性（P = 0.571），表明HCV和rs11820062基因型之间对HCV感染慢性化的作用为相互独立。

3 讨　论

HCV是一种RNA病毒，属于黄病毒科，由包膜、衣壳和核心3部分组成，其结构蛋白为C、E1、E2，非结构蛋白包括VS2、NS3、NS4A、S4B、NS5A、NS5B。HCV基因组呈现较高的变异性，Simmonds系统命名法将HCV分为6个型和11个亚型，不同的基因型是指HCV核酸序列差异超过30 %～50 %[5, 12]。通过变异可以逃避宿主的免疫监视，致使病毒持续存在，诱发慢性感染。因此，不同HCV基因型与病毒在宿主体内感染转归存在密切关联。本研究结果显示，HCV基因型和丙型肝炎感染慢性化之间存在关联，与HCV非1b基因型相比，1b型和混合型更易发展为慢性感染。与以往研究结果一致[13]。中国大陆地区以1b型感染为主，HCV病毒毒力、复制速度等方面的特性均与HCV病毒基因型直接相关[14]。研究表明，HCV 1型病毒的体内复制速度明显高于其他基因型，而1b基因型患者肝脏组织学分级、病程进展速度也明显高于2型[15]。

许多参与免疫过程的基因可以影响HCV感染结局，研究发现，TLR7（Toll-like receptor 7）、IL-18（interleukin-18）及维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）基因多态性与丙型肝炎易感性和感染结局均有一定关联[16–18]。而编码NF-κB蛋白的NF-κB家族基因多态性也与众多疾病存在关联。其中RELA基因编码主要的NF-κB亚组蛋白p65 [19]。RELA低表达和肝纤维化的进程明显相关，RELA基因敲除小鼠会因为肝坏死而导致胚死亡[20]。本研究结果显示，在隐性模型中，携带有rs11820062 TT基因型的患者有慢性感染倾向。研究表明，HCV感染后的肝脏组织及HCV核心蛋白转染后的细胞中可以看到NF-kB的活化及含量升高，NF-κB的活化抵制了肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡过程[21]。研究发现，HCV la型病毒核心蛋白表现为抑制NF-κB的活化，而1b型却促进NF-κB的活化，不同基因型HCV对NF-κB功能具有不同的调节作用[22]。本研究结果表明，HCV基因型和HCV感染慢性化之间存在关联，携带有rs11820062 TT基因型的患者存在慢性感染倾向。提示，RELA基因突变，可能会影响NF-κB表达水平，从而抑制HCV感染后肝细胞的细胞凋亡过程，使其逃避免疫监视，致使丙型肝炎慢性化感染；交互作用分析表明，HCV基因型和rs11820062位点之间对HCV感染慢性化的影响是相互独立的。

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