2. 山东第一医科大学临床与基础医学院病理生理学系, 山东 济南 250117;
3. 山西省临汾市中心医院病理科, 山西 临汾 041099;
4. 聊城市传染病医院病理科, 山东 聊城 252002
2. Department of Pathophysiology, School of Clinical and Basic Medicine, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250117 China;
3. Department of Pathology, Linfen Central Hospital, Linfen 041099 China;
4. Department of Pathology, Liaocheng Infectious Disease Hospital, Liaocheng 252002 China
放射性肺损伤（radiation-nduced lung injury，RILI） 是放射治疗胸部肿瘤所引起的常见并发症，早期主要以肺炎（adiation pneumonia，RP）为主，后期发展为辐射纤维化（radiation fibrosis，RF） [1]。在RILI的临床治疗中主要以抗生素、抗组胺药物和激素治疗药物为主，氨磷汀是目前FDA批准的唯一的放射保护剂，但是由于其明显的副作用如低耐受性、严重恶心和低血压，限制了其在临床的应用[2-3]。间充质干细胞（esenchymal stem cell, MSC）是一类多功能干细胞，由于其自身的低免疫原性、多向分化潜能、来源丰富而备受关注，在RILI治疗中具有调节炎症反应和受损组织修复的功能[4]。其中骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）是骨髓中存在的一类非造血干细胞，除自身的多向分化潜能之外，还具有免疫和造血功能。在肺部免疫细胞中，巨噬细胞是固有免疫中重要的效应细胞，按照其发挥的功能不同，巨噬细胞可以分为具有促炎作用的M1型巨噬细胞和具有抗炎作用的M2型巨噬细胞 [5]。最近研究表明，骨髓间充质干细胞具有减轻放射性肺损伤急性炎症作用，但其具体作用机制尚不清楚。本研究拟从巨噬细胞极化角度，研究骨髓间充质干细胞减轻放射性肺损伤的作用机制，进一步明确间充质干细胞在治疗RILI中的抗炎能力，为其治疗和预防提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 材料C57BL/6 SPF级小鼠45只，雄性，6～8周龄，体重18～20 g，购自山东省济南朋悦实验动物有限公司。实验动物饲养于山东省医学科学院动物房，室内温度26℃。将动物平均分为Control组、Model组和BMSCs治疗组，每组15只。骨髓间充质干细胞（来源于本实验室）、山羊抗兔（1∶50，中杉金桥）、IL-6（bs-0782R，Bioss）、TNF-α（bs-10802R，Bioss）、山羊抗兔（ZB-2301，中杉金桥）、DAB（ZLI-9018,中杉金桥）、山羊抗鼠（1∶50，中杉金桥）、F4/80（1∶100，bsm-34028M，Bioss）、CD86（1∶100，bs-1035R，Bioss）、CD206（1∶100，18704-1-AP，Proteintech）、羊抗鼠488（1∶200，ZF-0512，中杉金桥）、山羊抗兔594（1∶200，ZF-0516，中杉金桥）、E-cadherin（1∶1000，bs-1519R，Bioss）、N-cadherin（1∶1000，22018-1-AP，Proteintech）、Vimentin（1∶2000，10366-1-AP，Proteintech）、β-actin（1∶1000，66009-I-Ig，Proteintech）、生物辐照仪（RS2000X-Ray，美国Rad source）、TS100型倒置荧光显微镜（武汉赛维尔）、3D扫描仪（3D Histech数字病理切片扫描仪，匈牙利）、组织匀浆机（高速组织研磨仪，武汉赛维尔）、BIO-RAD ChemiDoc凝胶成像系统（美国伯乐）。
1.2 模型构建及BMSCs干预Model组和BMSCs治疗组小鼠用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行腹腔注射，等待小鼠麻醉后，将其放在照射台，采用6 MV的X射线进行单次胸部照射，照射部位为头部以下、剑突以上，剂量为20 Gy，剂量率为2 Gy/min；对照组不做任何处理。BMSCs治疗组于照射后6 h之内通过尾静脉注射Brdu标记的BMSCs（1 × 106 cells/只），其余条件同Control组相同。
1.3 HE染色 （hematoxylin-eosin staining，HE）石蜡切片脱蜡梯度制水后，PBS洗涤3次，每次5 min，纯水洗涤1次，5 min；放日Harris苏木精中染色1 min，自然水洗1 min；1%盐酸酒精分化液分化30 s后，自来水洗5 min；将切片放入伊红染色2 min，分别经过85%酒精5 s、90%酒精5 s、95%酒精I 1 min、95%酒精II 1 min、无水乙醇I 3 min、无水乙醇II 3 min、二甲苯I 2 min、二甲苯II 2 min，中性树胶封片。
1.4 免疫组化 （immunohistochemistry，IHC）石蜡切片经过烤片、脱蜡梯度制水后，用0.3%的过氧化氢溶液室温灭活内源性过氧化物酶20 min，PBS缓冲液洗涤3次后，用EDTA抗原修复液进行抗原修复，恢复室温并用PBS洗涤3次，每次5 min；用5%的山羊血清37℃孵育30 min，不洗，滴加一抗IL-6（1∶300，bs-0782R，Bioss）和TNF-α（1∶300，bs-10802R，Bioss）进行过夜孵育，第2天，PBS洗涤3次，每次5 min；滴加山羊抗兔（1∶10000）在37℃湿盒孵育，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min；用配好的DAB溶液镜下显色，纯水终止显色。苏木素染核1 min，用1%的盐酸酒精分化液分化30 s，冲水反蓝10 min，梯度脱水脱乙醇，用中性树胶进行封片。
1.5 免疫荧光 （Immunofluorescence，IF）石蜡切片烤片1 h，透明剂中3 h进行脱蜡，依次经过由高到低浓度酒精进行制水，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；利用EDTA抗原修复液在高压锅中修复20 min，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；滴加5%的山羊血清，在37℃恒温箱中孵育30 min，甩干后分别滴加F4/80和CD86、F4/80和CD206孵育，4℃过夜。第2天拿出复温1 h，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；甩干后滴加羊抗鼠488和山羊抗兔594，恒温箱37℃孵育1 h，PBS缓冲液洗3次，每次5 min；用含DAPI的封片机剂进行封片。在3D病理切片扫描仪下观察巨噬细胞数量变化。
1.6 免疫蛋白印迹称取小鼠新鲜肺组织50~100 mg于EP管中，加入预冷的生理盐水以去除组织表面的血液，将组织放入配置好的500 uL的蛋白裂解液中（RIPA裂解液：蛋白没抑制剂PMSF = 100∶1），在组织匀浆机（高速组织研磨仪，武汉赛维尔）上进行高速振碎，冰上静止10 min，使其充分裂解，4℃，12000 r低温离心15 min，吸取上清至新的EP管中。通过BCA发测定蛋白浓度后加入上清体积1/4的5x蛋白质凝胶电泳上样缓冲液，混匀后，在100℃的水中煮沸20 min，冷却后−20℃短期保存备用。制备8%聚丙烯酰胺凝胶后，按照每孔10 uL上样，压缩胶恒压80 V 25 min，分离胶120 V进行电泳，恒流300 mA 1 h将蛋白转移至PVDF膜（甲醇浸泡2 min激活），随后使用5%的脱脂奶粉室温封闭1.5 h，1×TBST洗膜3次，分别按如下稀释比例加入一抗：E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin，4℃冰箱孵育过夜。次日室温复温1 h，1×TBST溶液，10 min/次，成像并拍照（BIO-RAD ChemiDoc凝胶成像系统，美国伯乐），Image Lab分析条带灰度值。
1.7 统计学分析通过GraphPad Prism9.0软件进行统计分析并进行数据绘图，n = 3，分析不同组间比较采用独立样本t检验；P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 肺部病理形态结构变化为验证RILI小鼠模型是否建造成功以及BMSCs干预的疗效，我们通过HE染色来观察小鼠肺部结构变化（如图1所示），Control组结构正常且清晰，少有炎性渗出；Model组小鼠肺组织血管扩张充血，肺间隔明显增厚，炎细胞浸润，II型肺泡细胞明显减少且巨噬细胞明显增加，说明RILI小鼠模型的建模成功；BMSCs治疗组整体炎症较Model组减轻，II型肺泡细胞明显增多且巨噬细胞明显减少，说明BMSCs具有减轻放射性肺损伤炎症的能力。
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图 1 肺部组织病理学形态变化 Figure 1 Histopathological morphological changes in the lung |
为进一步验证BMSCs的抗炎能力，我们通过免疫组织化学技术检测肺组织炎症因子IL-6和TNF-α表达水平。结果显示，与Control组相比，炎症因子 IL-6和TNF-α的表达在Model组中的表达显著增高（P < 0.01），在经过BMSCs尾静脉注射治疗后，炎症因子表达显著下降（P < 0.05, P < 0.01），如图2所示。
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图 2 小鼠肺组织炎症因子IL-6和TNF-α在Control组、Model组、BMSCs组表达变化（比例尺50 μm） Figure 2 The expression of inflammatory factors IL-6 and TNF in mouse lung tissue in the control, model, and BMSCs groups （scale, 50 μm） |
我们通过免疫荧光技术检测肺组织中巨噬细胞的极化情况，巨噬细胞的极化主要有两种，即M1促炎型和M2抗炎型。我们用巨噬细胞特异性标志物F4/80来观察整体巨噬细胞的表达情况，通过M1型特异性物CD86和M2型特异性标志物CD206来观察巨噬细胞极化的表达水平。各组小鼠F4/80和CD86的阳性细胞结果显示，与Model组相比，CD86在BMSCs治疗组的阳性细胞数量显著降低（P < 0.05）。与Control组相比，Model组F4/80和CD86的阳性细胞数量显著增加（P < 0.05）。如图3A所示。各组小鼠F4/80和C206的阳性细胞结果显示，与Model组相比，CD206在BMSCs治疗组的阳性细胞数量显著增高（P < 0.01）。与Control组相比，Model组F4/80和CD206的阳性细胞数量显著降低（P < 0.05）。如图3B所示。
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图 3 免疫荧光检测巨噬细胞M1型和M2型标记物的表达变化（比例尺50 μm） Figure 3 Changes in the expression of macrophage M1-type and M2-type markers with immunofluorescence staining （scale, 50 μm） 注：A图为免疫荧光检测肺组织中F4/80、CD86的表达变化；B图为免疫荧光检测肺组织中F4/80、CD206的表达变化。 |
在放射性肺损伤的急性期利用BMSCs进行干预，通过影响巨噬细胞的M1型和M2型的相互转化，进而影响EMT发展的进程。为了进一步验证我们的假设，采用免疫蛋白印迹检测各组小鼠肺组织中EMT特征性标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达水平。结果显示，与Control组相比，N-cadherin和Vimentin在Model组表达显著升高（P < 0.05），BMSCs组中N-cadherin和Vimentin表达显著降低（P < 0.05, P < 0.01）。如图4所示。
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图 4 免疫蛋白印迹技术检测肺组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平（比例尺为50 μm） Figure 4 The expression levels of E-cadherin, N-cadherin, and vimentin in lung tissue by Western blot （scale, 50 μm） 注：*为P <0.05；**为P <0.01。 |
放射性肺损伤是放疗后多种细胞和细胞因子所共同作用的结果，目前发生概率为20%，分为炎症前期和肺纤维化时期 [6]。研究发现，肺部对于辐射更加敏感，在治疗期间，单次、全胸、高剂量率暴露于X射线的致死剂量（LD50）约为10 Gy，因此肿瘤的控制受限 [7]。放射性肺损伤严重患者由于肺部纤维化导致呼吸困难、生活质量下降且危及生命。根据细胞因子假说，组织细胞在辐射后产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）刺激上皮细胞、血管内皮细胞等生成炎症因子，主要包括TNF-α、IL-6、转化生长因子-β1（TGF-β1）等，大量的细胞因子会刺激成纤维细胞的分裂和增值，进一步发展为RF [8-10]。目前临床治疗因药物的副作用，限制了其临床应用。因此，探寻针对RILI的特定治疗方法亟待解决。
肺部巨噬细胞位于肺泡腔中，是呼吸道的第一道防线，按照其功能分为促炎的M1型巨噬细胞和抗炎的M2型巨噬细胞，二者在维持肺部炎症环境和RILI进程中发挥重要作用 [5，11]。辐射损伤后，巨噬细胞发展成激活的M1型或M2型转变为M1型，分泌的大量炎症因子加快炎症的发生 [11-12]。在低氧和辐射的联合作用下，巨噬细胞会产生更多的ROS并引起活性氧级联，进而引起巨噬细胞向M1型极化，促进RP的进程 [13]。RILI中晚期，低浓度的ROS会促进巨噬细胞向M2型极化，促进上皮-间质转化，造成过多的胶原和细胞外基质的沉积，最终形成RF [14]。干细胞由于其自身的优点被广泛的应用于各种疾病治疗的研究 [15]。研究发现，脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs）的应用导致促炎细胞因子表达降低，相反抗炎细胞因子的表达增高 [8, 11, 15]。因此，推测干细胞可能在M1和M2型巨噬细胞相互转变的过程中发挥重要作用，进而影响急性期EMT的发展。
研究表明，放射性肺损伤在ADSCs治疗后炎因子的表达显著下降[8, 11, 16, 17, 20]，同时M1型巨噬细胞抑制细胞增殖并导致组织损伤，而M2型巨噬细胞促进细胞增殖和组织修复[18, 19, 21]。之前的研究也发现BMSCs和胎盘间充质干细胞（placental mesenchymal stem cells, pMSCs）在免疫抑制特性使得M1型向M2型极化，抑制疾病炎症进程促进组织修复[22-24]，而巨噬细胞M1型和M2型在纤维化进展中发挥重要作用[5, 11-14]。在本研究中，Model组小鼠肺部损伤明显，出现典型的病理变化，如肺组织血管扩张充血，肺间隔明显增厚，炎细胞浸润，且炎症因子IL-6和TNF-α的表达明显增加，同时M1型巨噬细胞标志物CD86表达明显增加，与前期研究相符[16-20]，而BMSCs组上述病变明显减轻并且炎症因子表达明显减少，且M2性巨噬细标志物CD206明显增加。综上，放射性肺损伤模型的建立成功，并验证了BMSCs针对RILI炎症的疗效。初步的机制研究也表明BMSCs组中N-cadherin和Vimentin表达显著降低（P < 0.05, P < 0.01），提示在放射性肺损伤急性期应用BMSCs进行干预，上皮间质转化早期分子机制有逆转。
综上所述，本研究显示，骨髓间充质干细胞治疗放射性肺损伤效果显著。干细胞可能通过影响M1型和M2型巨噬细胞之间相互极化来抑制RILI早期进程，但具体机制需要进一步研究。因此干细胞调节巨噬细胞极化也为临床治疗提供了一种新的方式。
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