2. 浙江中医药大学，浙江 杭州 310053
2. Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 310053 China
随着国家海军战略由近海防御转向远海护卫，海军军事训练和作战任务不断加重，核潜艇作为我国杀手锏武器、作为维护海洋权益和领土完整的重要战略威慑力量，近年来核潜艇长远航战备值班和训练常态化、多样化，长远航频率增加、训练强度加大，由于其遂行任务时的机动性、隐蔽性以及所处环境的特殊性[1] ，核辐射意外及操作失误几率增加，加强核辐射防护对于提高我军战斗力具有重要作用。另外，随着科技的进步，辐射与人们生活密切相关[2]，随之而来的辐射损伤也在逐渐增加，如接受多次放射性治疗的肿瘤患者、核电站工作人员[3]、从事核医学诊断工作人员、放射性矿藏开采人员、放射性药品生产人员等都可能受到辐射损伤。再加国家形势风云变幻，核战争的爆发、核事故的发生[4]、核恐怖事件，使得受辐射损伤的人可能越来越多。加强辐射损伤的医学救援和防护[5-6]已不容忽视。多年来，人们一直在努力寻找合适的辐射防护对策，尽管经过几十年的研究，抗辐射药物[7]的研究一直是药物研究的热点之一，对辐射损伤有效的联合用药治疗措施依然是世界难题难点。
WR-2721又名氨磷汀，是一种有机硫代磷酸盐，有着较为全面的辐射防护作用[8]，是国际权威机构认可的第一个广谱细胞保护剂。多糖广泛存在于动物、植物及微生物中，是生命有机体的重要组成成分，具有很好的抗辐射效果[9]，香菇多糖（lentian，LNT）是从担子菌纲伞菌香菇属香菇菌（lentinus edodes）的子实体中提取分离出来的一种多糖，香菇多糖具抗恶性肿瘤、抗病毒、抗感染、抗辐射、抗糖尿病、提高免疫、抗氧化、抗疲劳等多方面功效[10]；细胞因子具有重要的生理作用，白介素-11（Iinterleukin-11，IL-11）是由骨髓基质细胞分泌的一种多效能细胞因子，是早期造血干细胞生长刺激因子之一，能促进骨髓粒细胞、巨核祖细胞的增殖分化，可明显提高外周白细胞（WBC）及血小板（PLT）的数量[11]，具有动员外周血造血干/祖细胞的作用。粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是目前公认的促白细胞和粒细胞生成的有效药物，在骨髓造血干细胞的增殖分化中，可刺激粒-单核系祖细胞分化为粒细胞[12]。联合用药是一种有效用药方式，增强药物疗效，降低药物副作用，在抗肿瘤[13]、抗感染[14]、抗凝血[15]、降压[16]等方面具有广泛的应用。为了进一步提高抗辐射效果，本文研究了WR-2721与香菇多糖、rhIL-11、rhG-CSF联合应用对辐射损伤小鼠在小鼠脾脏指数、胸腺指数、血清SOD、MDA、IL-11、TNF-α等方面的协同保护作用，旨在提供一种有效的联合治疗用药方案。
1 材料与方法 1.1 实验仪器MC759紫外-可见分光光度计（上海第三分析仪器厂），离心机（美国Beckman公司），显微镜（日本Olympus公司），血细胞计数仪（日本Nihon Kohden公司），恒温水浴加热锅（余兆新波仪表有限公司），酶标仪（美国Thermo公司），分析天平（北京赛多利斯分析系统有限公司），电子天平（北京赛多利斯分析系统有限公司），冰箱（青岛海尔集团股份有限公司）。
1.2 实验试材WR-2721（湖北葛店人福药业有限公司，批号：20090901）；香菇多糖（湖北创力药业有限公司，批号：20090801）；rhIL-11（北京双鹭药业股份有限公司，标示量1.5 mg/支，活性0.8 × 107 IU·mg−1，批号：20091001）；rhG-CSF（上海三维生物技术有限公司，标示量150 μg·ml−1，活性9.0 × 106 IU·ml−1，批号：20091201）；血液稀释液（上海东湖生物医药有限公司，批号：100722）；溶血剂（上海东湖生物医药有限公司，批号：20100521）；血清IL-2、TNF-α的Elisa试剂盒（R&D公司，批号20110301A）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20101027）；丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20101027）；其他试剂均为分析纯。
1.3 实验方法 1.3.1 实验模型ICR小鼠70只，SPF级，体重17～19 g，雄性。购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证编号：2008001605959。许可证号：SCXK（沪）2008—0016。在香菇多糖给药7 d后，于第二军医大学辐照室用60Co γ射线一次性全身均匀照射，同时在照前15～30 min腹腔注射WR-2721，剂量率为0.8 Gy·min−1，吸收剂量为5 Gy。
实验分组，小鼠适应性喂养3 d后，按体重采用随机数字表，分为7组：（1）对照组（每天按0.2 ml/20 g灌喂给予蒸馏水，不照射）。（2）模型组（每天按0.2 ml/20 g灌喂给予蒸馏水，照射）。（3）WR-2721组（照前15～30 min按400 mg·kg−1腹腔注射WR-2721，其余每天按0.2 ml/20 g灌喂给予蒸馏水）；（4）香菇多糖&细胞因子组（照前连续7 d及照后连续14 d按400 mg·kg−1灌喂给予香菇多糖，照后连续7 d按200 μg·kg−1皮下注射rhIL-11及30 μg·kg−1皮下注射rhG-CSF）。（5）WR-2721 &香菇多糖组（照前连续7 d及照后连续14 d按400 mg·kg −1灌喂给予香菇多糖，照前15～30 min按400 mg·kg−1腹腔注射WR-2721）；（6）WR-2721 &细胞因子组（照前15～30 min按400 mg·kg −1腹腔注射WR-2721，照后连续7 d按200 μg·kg−1皮下注射rhIL-11及30 μg·kg−1皮下注射rhG-CSF，其余每天按0.2 ml/20 g灌喂给予蒸馏水）。（7）WR-2721 &香菇多糖&细胞因子组（照前连续7 d及照后连续14 d按400 mg·kg −1灌喂给予香菇多糖，照前15～30 min按400 mg·kg−1腹腔注射WR-2721，照后连续7 d按200 μg·kg−1皮下注射rhIL-11及30 μg·kg−1皮下注射rhG-CSF）。各组小鼠灌喂或注射均按0.2 ml/20 g给药。
1.3.2 检测指标 1.3.2.1 脏器指数照射后第14天测体重，摘眼球放血后脱颈椎处死小鼠，迅速分离脾脏、胸腺，精密称定脏器湿重，分别计算脾脏指数、胸腺指数。
脏器指数 = 脏器湿重/体重 × 1000
1.3.2.2 血清超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量照射后第14天，摘眼球取血，采集血液约0.5 ml于1.5 ml的Eppendorf管中，4℃静置1 h，1800 r·min−1离心20 min，取上清置于无菌Eppendorf管中。采用南京建成SOD测试盒测定血清SOD活性，其中样品的取样量为20 μl。采用南京建成MDA测试盒测定血清MDA含量，其中样品的取样量为0.1 ml。
1.3.2.3 血清IL-2、TNF-α含量照射后第14天，摘眼球取血，采集血液约0.5 ml于1.5 ml的Eppendorf管中，4℃静置1 h，1800 r·min−1离心20 min，取上清置于无菌Eppendorf管中。按Elisa试剂盒操作说明书操作。
1.3.3 统计学方法所有实验数据均采用Microsoft Excel软件统计。实验数据以
由表1中数据可知，LNT&ck组的脾脏指数显著高于其它各组（P < 0.05），而其它各组的脾脏指数差异无统计学意义（ P > 0.05）。提示香菇多糖与细胞因子合用对辐射损伤小鼠的脾脏具有一定保护作用；同时数据表明，各受照组小鼠的胸腺指数均低于对照组，有的甚至差异有统计学意义（ P < 0.05），且各给药组均高于模型组，有的甚至差异有统计学意义（ P < 0.05）。LNT&ck&WR组的胸腺指数均高于其他各受照组，其中较模型组、LNT&ck组差异有统计学意义（ P < 0.05或 P < 0.01），其他各给药组之间则差异无统计学意义（ P > 0.05）。
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表 1 各组小鼠脾脏指数和胸腺指数的测定结果（
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由表2中数据可知，除LNT&ck&WR组外，其它各组的SOD活性均非常显著低于对照组（P < 0.01），且各给药组均非常明显高于模型组（ P < 0.01）。LNT&ck&WR组非常显著高于其他各受照组（ P < 0.01），其他各给药组之间则差异无统计学意义。
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表 2 各组小鼠SOD活性的测定结果（
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由表3中数据可知，各受照组小鼠的MDA含量均高于对照组，除LNT&ck&WR组外，其它各组均与对照组差异有统计学意义（P < 0.05），各给药组均低于模型组；ck&WR组、LNT&ck&WR组较模型组差异有统计学意义（ P < 0.05或 P < 0.01）。LNT&ck&WR组均低于其他各给药组，但差异无统计学意义（ P > 0.05），其他各给药组之间则差异无统计学意义。提示香菇多糖、细胞因子及WR-2721均有降低辐射小鼠MDA含量的作用。
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表 3 各组小鼠MDA含量的测定结果（
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由表4中数据可知，LNT&ck&WR组的IL-2含量均非常明显高于其它各组（P < 0.05或 P < 0.01），其它各给药组的IL-2含量均高于模型组，但差异无统计学意义（ P > 0.05），其他各给药组之间则差异无统计学意义。提示香菇多糖、细胞因子及WR-2721均有提高辐射小鼠血清IL-2含量的作用，且三者联合应用，有一定的促进作用；同时数据表明，各给药组的TNF-α含量均明显高于模型组（ P < 0.01），LNT&ck&WR组的TNF-α含量均非常明显高于其它各组（ P < 0.01），其他各给药组之间则无显著性差异。
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表 4 各组小鼠血清IL-2血清TNF-α的测定结果（
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脾脏是是机体最大的淋巴器官，是免疫应答的主要场所，也是对抗原产生免疫效应物质的重要基地；同时也是淋巴细胞生长、分裂、分化所在地。脾脏对机体正常的造血和免疫功能起着重要作用，脾脏对辐射也十分敏感。胸腺属于中枢淋巴器官，其主要功能是培育各种T淋巴细胞，并通过基质细胞分泌胸腺激素和细胞因子来调节免疫功能，胸腺细胞的功能直接反应了机体T淋巴细胞的功能。辐射使脾脏细胞、胸腺细胞大量坏死和凋亡，使脾脏与胸腺体积萎缩，重量迅速减少。因此脾脏指数和胸腺指数能反应脾脏和胸腺的结构和功能。
本实验结果显示：照射后第14天，模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数明显低于对照组（P < 0.05），表明辐射能降低小鼠的脾脏指数及胸腺指数。从实验结果可以看出：LNT&ck组的脾脏指数明显高于其它各组（ P < 0.05），而其它各组之间的脾脏指数则均无明显差异，其可能原因还需进一步探讨。各给药组小鼠的胸腺指数均高于模型组；LNT&ck&WR组的胸腺指数高于或显著高于其它各给药组；LNT&WR组、ck&WR组的胸腺指数则高于WR-2721组，但没有统计学意义。说明香菇多糖、细胞因子及WR-2721均有提高辐射小鼠胸腺指数的作用，且联合应用更有一定的促进作用。
3.2 不同药物组合对辐射小鼠体内抗氧化系统的影响骨辐射导致机体产生大量氧自由基，引起强烈的脂质过氧化反应，产生大量异常代谢物质，破坏核酸、蛋白质、酶等生物大分子，导致细胞、组织损伤。SOD是天然的酶性自由基清除剂，其酶活力的高低间接反应了机体清除氧自由基能力大小；MDA是脂质过氧化物的分解产物，其含量反映了脂质过氧化反应程度的强弱以及机体细胞受自由基攻击的程度[17-18]。
本次实验结果显示：照射后模型组小鼠血清SOD水平降低、MDA含量增高，表明照射后动物体内产生氧化损伤，脂质过氧化物的体内蓄积量增大。从实验结果可以看出，LNT&ck&WR组的SOD活性均显著高于其它各受照组（P < 0.01），其他各给药组之间的SOD活性差异无统计学意义；LNT&ck&WR组的MDA含量均低于其它各受照组，但仅较模型组差异有统计学意义（ P < 0.01）。LNT&WR组及ck&WR组的SOD活性和MDA含量与WR-2721组差异无统计学意义（ P > 0.05）。表明香菇多糖、细胞因子、WR-2721均具有提高SOD活力、降低MDA含量的作用，联合应用后更具有促进作用。
3.3 不同药物组合对辐射小鼠血清细胞因子水平的影响IL-2和TNF-α是2个重要的介导免疫反应的细胞因子，是维持机体免疫功能的关键细胞因子[19]，它能促进T细胞存活和增殖，又可促进抗肿瘤细胞免疫效应细胞NK、特异性CTL杀伤活性。
本实验结果显示：模型组的IL-2和TNF-α含量在照射后显著下降，表明辐射影响小鼠的IL-2 和TNF-α含量。LNT&ck&WR组的IL-2及TNF-α含量均显著高于其它各受照组（P < 0.05或 P < 0.01）。LNT&WR组及ck&WR组的IL-2及TNF-α含量与WR-2721组无明显差异（ P > 0.05）。说明香菇多糖、细胞因子及WR-2721联合应用更具有提高辐射小鼠血清细胞因子IL-2及TNF-α含量的作用。
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