放射性肺纤维化（Radiation-induced pulmonary fibrosis, RIPF）是胸部肿瘤放射治疗中常见的慢性并发症[1- 2]。目前临床上还没有针对RIPF的特定治疗方法，主要通过糖皮质激素和抗炎药物缓解症状及补氧提高氧气供给[3-4]。因此，寻找一种更有效的放射性肺纤维化的治疗方法仍是临床上亟待解决的问题。
已有研究报道间充质干细胞可以通过替代受损的肺上皮细胞，分泌抗炎和抗纤维化因子促进组织修复[5]。其中脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs) 凭借低免疫原性和易于体外增殖，不需要侵入性采集程序等优点备受关注，且已有临床实验报道UC-MSCs能够有效缓解RIPF的症状，降低RIPF的肺组织致密度[6]。但UC-MSCs的应用还存在一定的问题，如UC-MSCs会分泌多种促炎因子到受损组织，这种促炎表型可能在某些情况下反而会促进纤维化的发生[7-8]。因此，多角度和深入探讨UC-MSCs治疗RIPF的机制，对于UC-MSC的应用开发和安全性评价有重要的意义。
近期的研究表明，肺泡细胞衰老是放射性肺纤维化的始动因素之一[9-11]。因此，本研究构建了单侧RILF小鼠模型并进行UC-MSCs移植治疗，通过观察肺细胞衰老和组织纤维化指标的变化，研究在体内UC-MSCs对肺内细胞衰老的影响，并对衰老相关的信号通路进行初步探究，旨在为UC-MSCs治疗RIPF的研究提供一定的数据支持。
1 材料与方法 1.1 动物及分组C57BL/6 雄性小鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司，IRM-DWLL-2020160），6～8周龄，饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物房，环境洁净、恒温恒湿。将小鼠随机分为4组，分别为Ctrl组：单纯注射PBS；IR组：照射，注射PBS；UC-MSCs组：注射UC-MSCs；IR+UC组：照射后注射UC-MSCs。
1.2 放射性肺纤维化模型制备及细胞注射3.5%水合氯醛麻醉小鼠，用胶带将小鼠四肢固定将右侧胸部暴露在照射野内，调整角度，确保小鼠仅进行单侧右肺的照射。X射线（中国医学科学院放射医学研究所，RAD SOURCE RS-2000）剂量率2.7 Gy/min 总照射剂量17 Gy。待小鼠苏醒后，放回隔离环境内饲养。照射后3个月，尾静脉注射UC-MSCs，3×106 cells/只，Ctrl组进行100 μL PBS溶液的注射。
1.3 样本采集、脏器比统计及病理图片收集照射后每7 d对小鼠进行生存情况记录，照射后6个月脱颈处死小鼠。分离肺组织，拍照记录肺组织大体形态。单侧肺分别称重，计算脏器比 = 肺部重量/体重×100%，绘制图表。取右肺第二叶用4%多聚甲醛固定，其余右肺组织存储于液氮以便后续提取蛋白和RNA。
1.4 HE染色、Masson染色4%多聚甲醛固定48 h后，脱水、石蜡包埋，制备厚度为5 μm的组织病理切片。切片60℃烘烤10～12 h，依次通过二甲苯2次，每次15 min；无水乙醇5 min；95%乙醇5 min；85%乙醇5 min；75%乙醇5 min；65%乙醇5 min脱蜡至水。
切片浸入伊红染液2 min，染色后浸入水缸流水冲洗，再浸入苏木素染液30 s，染色后流水冲洗，最后再次浸入伊红染液中复染1 min，流水冲洗。通过65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇各3 s、无水乙醇15 s、二甲苯5 min脱水后，用中性树脂封片。
使用Masson染色试剂盒（G1346，Solarbio），依照试剂制造商提供的说明进行染色。染色后对切片脱水处理，中性树脂封片。
1.5 免疫组化切片60℃烘烤10～12 h，脱蜡至水后浸入抗原修复液中通过高压加热进行抗原修复。室温放置2 h，PBS缓冲液清洗3次，每次5 min。组化笔圈出组织部分，滴加过氧化物酶阻断剂避光放置15 min。PBS缓冲液浸洗3次，每次5 min，5%BSA室温封闭2 h。用5%BSA配置一抗 β-Gal 1∶200（66589-1-Ig，Proteintech），4℃孵育过夜。切片室温放置30 min，用PBS浸洗3次，每次5 min。增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（PV-9000，ORIGENE）孵育30 min，用PBS清洗3次，每次5 min。DAB（57355，abcam）染色20 s，清水冲洗。苏木精染色40 s，清水冲洗，脱水后中性树脂封片。
1.6 组织免疫荧光切片60℃烘烤10～12 h，脱蜡至水后浸入抗原修复液中通过高压加热进行抗原修复。室温放置2 h，PBS缓冲液清洗3次，每次5 min。组化笔圈出组织部分，滴加过氧化物酶阻断剂避光孵育15 min。PBS缓冲液浸洗3次，每次5 min，5%BSA室温封闭2 h。弃去封闭液，滴加5%BSA配置的一抗P21 1∶50（sc-6246, SANTA CRUZ）4℃孵育过夜。切片从4℃转移至室温避光静置30 min，用PBS缓冲液浸洗3次，每次5 min，5%BSA配置二抗Cy3-M 1∶500 (SA00009-1, Proteintech）室温孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min，DAPI封片。
1.7 qRT-PCR Trizol（Invitrogen）研磨组织提取RNA，逆转录试剂盒（RR036A，TAKARA）制备cDNA。采用CFX ConnecttM实时系统（BioRad）及qPCR MasterMix（G891-1，ABCAM）和所需引物，以GAPDH为内参根据试剂供应商的说明进行PCR。得出Ct值，根据公式2−∆∆Ct计算结果，分析SASP的表达。
引物序列：GAPDH-M-F AAGGTCATCCCAGAGCTGAA
GAPDH-M-R CTGCTTCACCACCTTCTTGA
IL6-M-F TACCACTTCACAAGTCGGAGGC
IL6-M-R CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC
IL-8-M-F GGTGATATTCGAGACCATTTACTG
IL-8-M-R GCCAACAGTAGCCTTCACCCA
IL-1β-M-F TGGACCTTCCAGGATGAGGACA
IL-1β-M-R GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG
1.8 Western Blot取部分肺组织加入RIPA裂解液（R0020，Solarbio）进行研磨，离心取上清，根据上清体积加入4× Blotting Buffer（3∶1 P1016, Solarbio）与PMSF（100∶1 P0100, Solarbio），100℃金属浴10 min。12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上，用1%BSA室温封闭2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。过夜4℃孵育一抗P16（1∶1000，SC-1661, SANTA CRUZ）P21（1∶500，SC-6246, SANTA CRUZ）、P53（1∶1000，#2524, CST）、p-P53（1∶1000 ，#9286, CST）。TBST洗膜3次，每次10 min，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG 1∶4000（Proteintech）孵育，最后TBST洗膜3次每次10 min。使用多功能凝胶成像仪（Bio-Rad公司）进行曝光显影。
1.9 图像处理及统计学分析使用GraphPad Prism8.0软件进行图片处理。IBM SPSS 22软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（
对C57BL/6小鼠行右肺单次照射构建RIPF模型，在照射后90 d尾静脉注射UC-MSCs进行治疗，照射后180 d进行取材处理（图1A）。建模成功后小鼠右侧胸部出现局部皮肤损伤（图1B）。结果显示，RIPF小鼠经过UC-MSCs治疗后生存率有所升高（图1C）。
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图 1 UC-MSCs缓解辐射诱导的肺纤维化 Figure 1 UC-MSCs alleviating radiation-induced pulmonary fibrosis 注：A：RIPF小鼠建模、注射UC-MSCs及取材实验设计示意图；B：小鼠单右侧照射建模后皮肤局部损伤；C：6个月实验周期内各组小鼠生存曲线；D：小鼠整体肺部病理大体图片；E：小鼠单侧肺部脏器比；F：小鼠病理切片Masson染色，蓝色染色部分显示胶原沉积情况（20X）；G：小鼠病理切片HE染色，显示肺部结构（20X） |
肺部病理结果显示经过照射的小鼠右侧肺叶呈现病态的深红猪肝色，经UC-MSCs治疗后的肺部趋于正常肺部的粉红色（图1D）。脏器比结果分析，RIPF小鼠的右肺脏器比较Ctrl组升高，而在UC-MSCs治疗后有一定程度的降低，但差异无统计学意义。受旁效应影响左侧肺部脏器比也呈现相同趋势（图1E）。HE染色结果显示，照射组小鼠的肺泡壁增厚，肺泡塌陷的病理特征在UC-MSCs治疗后均有所改善（图1G）。同时Masson染色结果也表明RIPF小鼠经过UC-MSCs治疗后肺内胶原沉积减少（图1F）。以上结果证明，UC-MSCs的移植注射能够改善辐射诱导的肺纤维化，且对正常小鼠肺部无明显不良影响。
2.2 UC-MSCs减轻RILF小鼠肺泡细胞衰老β-Gal组化染色的结果显示，RIPF小鼠肺部较正常小鼠肺内阳性染色细胞明显增多，而在经过UC-MSCs注射后阳性细胞数下降（图2A）。提取各组小鼠肺部组织RNA，通过qRT-PCR对肺内SASP因子（IL-6、IL-8、IL-1β）进行检测，结果可以看出经过UC-MSCs治疗后，RIPF小鼠IL-6、IL-8、IL-1β水平较IR组明显降低（t = 11.58，P < 0.05；t = 9.351，P < 0.05；t = 5.171，P < 0.05）（ 图2B）。且在β-Gal及PCR结果中都显示UC-MSCs移植不会促进正常小鼠细胞的衰老。通过以上结果，我们认为UC-MSCs的移植能够有效改善照射后小鼠肺组织细胞的衰老。
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图 2 UC-MSCs减轻RILF小鼠肺泡细胞衰老 Figure 2 2UC-MSCs attenuating alveolar cell senescence in RILF mice 注：A：小鼠肺组织病理切片β-Gal蛋白免疫组化染色评估肺内细胞衰老情况（20X）；B：qRT-PCR检测小鼠肺组织内SASP（IL-6、IL-8、IL-1β）基因水平表达 |
P53-P21及P16是细胞衰老的主要信号通路，本研究提取小鼠肺组织蛋白，WB检测衰老相关P53-P21及P16信号通路的改变。结果显示，RIPF小鼠肺内的P53、p-P53、P21及P16蛋白的高表达在经过UC-MSCs的治疗后均明显降低（图3A）。组织免疫荧光也显示，IR组RIPF小鼠肺内P21的表达水平较对照组明显升高，经过UC-MSCs治疗后P21的阳性细胞明显减少。作为衰老细胞的重要特征照射组肺内细胞体积明显肥大，在经UC-MSCs治疗后细胞体积减小并与正常小鼠相近（图3B）。因此，UC-MSCs可能是通过抑制P53-P21和P16的信号通路，缓解肺组织细胞的衰老。
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图 3 UC-MSCs抑制衰老相关P53-P21及P16信号通路 Figure 3 3UC-MSCs inhibiting senescence-associated P53-P21 and P16 signaling pathways 注：A:Western Blot分析小鼠肺组织内P53-P21、P16衰老相关蛋白表达量；B:免疫荧光分析肺泡内衰老相关蛋白P21表达情况 |
放射治疗是癌症治疗的重要组成部分，而胸部肿瘤放疗中引起的RIPF极大限制了放疗的效果[1-2]。RIPF的特点是肺内出现实质性病变，肺泡间隔增厚、胶原蛋白沉积，呼吸功能下降[12]。目前临床上使用的治疗方案以支持性治疗为主，例如使用类固醇进行抗炎治疗、氧疗和机械通气等缓解症状。肺移植是较为有效的治疗措施，但其应用受到很大的限制[13-15]。
有研究证实UC-MSCs可以通过抑制促炎症细胞因子水平（IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-2和IFN-γ），增强抗炎细胞因子IL-10的表达，减少巨噬细胞对受伤肺组织的浸润，调控MMP-2和TIMP-1的表达，减轻肺纤维化[16-17]。本研究的结果也证实了UC-MSCs对放射性肺纤维化的治疗作用，我们在照射后3个月的肺纤维化进展阶段通过尾静脉注射的方式进行了UC-MSCs的移植治疗，发现UC-MSCs的治疗能够在一定程度上提高纤维化后期小鼠的存活率，改善照射后小鼠肺泡结构，减轻胶原沉积，且对正常肺组织结构没有可见的影响。因此，UC-MSCs移植是一种有应用前景的RIPF治疗手段。
细胞衰老是一种进化上保守的稳定复制停滞状态，损伤积累会刺激细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 P16和P53-P21的活性，它们通过拮抗细胞周期蛋白依赖性激酶以阻断细胞周期进程[18]。越来越多的证据表明在RIPF的发病机制中，细胞衰老占据着重要的地位[9, 19]。胸部照射17.5 Gy小鼠表现出衰老的Ⅱ型肺泡上皮细胞（AEC II）增加[9]。通过靶向抑制NADPH氧化酶(NOX)来抑制细胞衰老可以预防并延缓肺纤维化的进展[20]。Zhou等认为，衰老细胞充当了主要负责启动和推动 RIPF 进展的永动机[21]。衰老细胞特别是衰老的AECII，可以通过多种机制促进 RIPF。当AECII衰老时，不能自我更新并产生肺泡上皮细胞来维持肺泡内的稳态和组织损伤后的上皮修复，但仍占据干细胞的生态位。此外，衰老的AECII可以通过引发氧化应激和炎症，启动异常组织修复过程和继发性衰老的持续恶化。这反过来又部分通过 ROS 和 SASP 导致正常组织结构和功能的破坏，最终导致肺纤维化[21]。
本研究中，RIPF小鼠肺内衰老相关分泌表型因子的高表达，肺泡细胞体积异常肥大以及衰老相关β-Gal免疫组化染色也证实了RIPF小鼠肺内有大量衰老细胞存在的现象[22-23]。而采用UC-MSCs移植后，肺组织中β-Gal阳性的衰老细胞明显减少，SASP因子也显著降低，表明UC-MSCs治疗能够有效的缓解纤维化肺内细胞的衰老情况。初步的机制研究也表明，UC-MSCs能抑制衰老通路蛋白P21、P53、p-P53及P16的表达。
综上，本研究结果表明，UC-MSCs可能通过抑制P53-P21及P16途径缓解肺组织细胞的衰老，减轻放射性肺纤维化，有望用于放射性肺损伤的治疗。在今后的研究中需进一步明确UC-MSCs缓解的衰老细胞类型，提出更有力的证据表明P53-P21及P16信号通路是UC-MSCs 抑制肺细胞衰老的主要途径。
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