评价放射损伤常用生物学检测技术有：外周血淋巴细胞染色体畸变率、淋巴细胞转化率和微核细胞率[1]，目前其被作为放射工作人员健康检查的重要项目[2-3]。随着新兴的检查仪器的研究和发展，淋巴细胞染色体、淋巴细胞转化率和微核细胞率的制片虽然有了全自动收获仪和制片仪，但仪器价格非常昂贵，且技术还尚未成熟，经常会出现破片等情况，全自动化仪器暂且未得到推广，目前大多数实验室仍然采取传统的手工方法来制片[4]。而手工操作需要在收集血标本后进行培养、提纯、收获、制片、染色[5-6]，整个过程耗时4 d，加上后期的镜下观察，导致体检机构对受检者报告出具和体检结果分析的周期较长，制约了对放射性人员体检工作的进度效率。经实验研究，发现有较大的优化空间，针对现在国家标准[7-8]作以下改进。
1 材料与方法 1.1 实验材料一次性采血针或绿头负压采血管、甲醇分析纯、1640培养基、氯化钾低渗液（0.075 mol/L）、冰醋酸分析纯、秋水碱、Giemsa染液、37℃孵箱和水浴箱、吸管、超净工作台、显微镜等。
1.2 标本获取外周血样品取自某一非放射接触者，且其近期内无急慢性疾病，半年内无射线和化学毒物接触史。用肝素抗凝负压采血管采集该受试人员静脉血5 mL 6支。其中3支以剂量率为1.002 Gy/min、剂量为2.8 Gy的60Coγ射线辐照作为试验组，另3支作为对照组。
1.3 实验方法 1.3.1 改进实验方法 1.3.1.1 标本接种和培养在超净工作台中，将辐照后标本1支，分别取0.8 mL加入5 mL淋巴细胞培养基共5瓶，将按比例接种好的淋巴细胞培养基充分混匀后，再将其放入37℃孵箱，避光，静置48 h[9]，取出培养基，加入10 µmol/mL的秋水碱，使其浓度为0.5 µmol/L时为止，放入37℃孵箱，静置20 h。取非辐照标本1支，重复上述步骤。
1.3.1.2 淋巴细胞染色体、转化细胞和微核细胞的分离提纯用吸液器抽去上清液，加入KCL低渗液（浓度∶0.075 mol/L）8 mL，充分混匀，再将低渗的淋巴细胞培养基按比例分成2份，一份静置1 min立即加固定液（无水甲醇∶冰醋酸=3∶1）1 mL预固定，另一份于37℃水浴箱中静置15 min；等到第二份淋巴细胞标本低渗到时间时，从水浴箱中取出，加入固定液1 mL预固定，充分混匀，注意不要起泡。将2份淋巴细胞培养标本混合。
将混合的淋巴细胞标本充分混匀不起泡，1 500 r/min离心10 min；用吸液器抽去上清液，加入固定液8 mL，混匀，静置20 min。1 500 r/min离心10 min后去上清液，此操作重复一次。
1.3.1.3 制片新购载玻片用浓硫酸、重铬酸钾浸泡脱碱，提前一天放4℃冰箱预冷，制成冰片；弃上清液后将提取的培养物垂直滴在冰片上，在酒精灯上迅速掠过1~2次固定。注意不要使玻片着火，自然干燥。
1.3.1.4 瑞氏-吉姆萨染色瑞氏-吉姆萨原液与磷酸缓冲液1∶10混合，用新鲜配制的瑞氏-吉姆萨染液染色10 min。用小束蒸馏水水平冲洗染色玻片，置晾片架上自然晾干，制成的检测片，在光学显微镜下观察。重复上述步骤，试验组和对照组制片各5张。
1.3.2 标准实验方法参照国家标准GBZ/T 248—2014和行业标准WS/T 187—1999常规培养法，用辐照和非辐照标本各2支分别接种淋巴细胞培养基各5瓶，培养收获，分别制成染色体检测片各5张和微核检测片各5张。
1.4 图像采集及统计学分析方法每个标本行5次重复实验，镜下观察分析并采集染色体分裂相、微核及转化淋巴细胞图像。将试验组和对照组的检测结果分别计算均值、标准差和P值，再用JMP软件将所得数据进行单项分析。检验水准α = 0.05。
2 结 果 2.1 淋巴细胞染色体畸变率、微核细胞率和转化率用统一标准采集正常人体外周全血，由一位实验室专业人员全过程独立完成，镜下观察，按国标GBZ/T 248—2014制片，每张检测片观察100个分裂相。将上述外周血标本按WS/T 187—1999制片，每张淋巴细胞微核片高倍镜下观察1 000个淋巴细胞，检测出微核淋巴细胞率，再观察100个淋巴细胞，计算出转化率。镜下观察染色体分裂相、转化淋巴细胞及微核，见图1A、图1B。再用改进的实验方法在一张玻片上同时观察受检标本的100个染色体分裂相和1 000个淋巴细胞的微核数，以及计算出100个淋巴细胞的转化率，见图1C。最后分别得出每张检测片的淋巴细胞染色体畸变率、微核细胞率和转化率，阳性观察见图1D、图1E。
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图 1 标准方法片、改进方法片和阳性片的镜下观察结果 Figure 1 Microscopic observation of sections prepared with standard and improved methods and positive section 注：A: 染色体分裂相10 × 10（X）; B: 转化淋巴细胞10 × 40（X）; C: 染色体的分裂相和淋巴细胞10 × 40（X）; D: 异常染色体分裂相10 × 100（X）; E: 微核淋巴细胞10 × 100（X） |
5次重复实验：标准方法对照组淋巴细胞染色体畸变率为0，试验组的淋巴细胞染色体畸变率均值为74.0%；改进方法对照组的淋巴细胞染色体畸变率为0，试验组的淋巴细胞染色体畸变率均值为75.8%。经统计分析，试验组两方法结果比较差异无统计学意义（t = 2.25，P = 0.054 6）。见表1。
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表 1 标准方法与改进方法结果对比 Table 1 Comparison of standard and improved methods |
5次重复实验，标准方法对照组的微核细胞率均值为1.4‰，试验组的微核细胞率均值为7.2‰；改进方法对照组的微核细胞率均指为1.2‰，试验组的微核细胞率均值为7.8‰。经统计分析，对照组两种方法比较、试验组两种方法比较，差异均无统计学意义(t对照组 = 0.447 2，P = 0.666 6；t试验组 = 1.133 9，P = 0.289 7)。见表1。
2.4 淋巴细胞转化率对比5次重复实验,标准方法对照组淋巴细胞转化率平均值为66.2%，试验组淋巴细胞转化率平均值为43.2%；改进方法对照组的淋巴细胞转化率平均值为65.4%，试验组淋巴细胞转化率平均值为43.6%。经统计分析，对照组两种方法比较、试验组两种方法比较，差异均无统计学意义（t对照组 =0.8，P = 0.446 8；t试验组 = 0.4，P = 0.699 6）。见表1。
采用JMP软件对改进方法和标准方法所得到的数据进行单向分析，得到对照组和试验组淋巴细胞染色体畸变率、微核细胞率、淋巴细胞转化率的分布结果，见图2。由t值和P值可见，改进方法结果与标准方法对试验组和对照组均无统计学统计学差异。
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图 2 试验组和对照组采用改进方法和标准方法所得结果的单向测试 Figure 2 One-way test of experimental and control groups prepared with improved and standard methods 注：A: 试验组染色体畸变率; B: 对照组微核细胞率; C: 试验组微核细胞率; D: 对照组淋巴细胞转化率; E: 试验组淋巴细胞转换率 |
淋巴细胞转化率不同方法对比上述结果统计分析显示，改进后的实验方法与标准方法所制片检测的结果一致。提示在进行淋巴细胞染色体、淋巴细胞转化率和微核细胞率制片时，可采用改进后的实验方法代替标准方法。
改进后的实验方法与标准方法不同在于：标准操作方法针对淋巴细胞染色体、微核和转化率3个项目[10-11]的检查需要对2次标本在2个不同时间段分别进行培养基的收获、提纯、制备，再分别在2张检测片上进行镜下观察[12-13]。而改进后的方法只需接种一瓶1640培养基，使用一套实验试剂和耗材，在同一时间完成实验，制成一张检测片，并在光学显微镜下同时观察受检者的淋巴细胞染色体畸变率、微核细胞率和转化率。
改进后的实验方法中，微核的培养过程有秋水仙素的接触[14]。本实验秋水仙素的浓度为0.5 µmol/L，改进方法的微核率与转化率检测结果与标准方法检测结果比较，差异无统计学意义，说明低剂量的秋水仙素对淋巴细胞的分化和微核的形成无影响。
改进后的实验方法的优势在于：①在全自动收获仪还尚未成熟，多数实验室采用手工操作，将淋巴细胞染色体和微核、转化率制片过程实验合并，可缩短人工实验时间，节省人力成本；②淋巴细胞染色体和微核细胞率、转化率检查的两个制片过程的兼容，将缩短淋巴细胞染色体畸变率、微核细胞率和淋巴细胞转化率检查的报告时间，提高工作效率；③显著降低了实验成本和仪器损耗。淋巴细胞培养基购买成本高，保质期短。在预防性体检项目取消收费的新政策趋势下，减少不必要的浪费，既是对本实验室负责，也是对国家资源的合理利用和保护。
综上，改进后的淋巴细胞培养收获制片实验方法，在体检机构高效开展放射性工作人员健康体检具有较大现实意义，值得进一步研究和探讨。
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