中国辐射卫生  2019, Vol. 28 Issue (6): 606-608, 613  DOI: 10.13491/j.issn.1004-714x.2019.06.002

引用本文 

侯殿俊, 马娅, 李洁清, 毛雪松, 朱伟. 电离辐射诱发人外周血miRNA-150表达水平的改变及意义[J]. 中国辐射卫生, 2019, 28(6): 606-608, 613. DOI: 10.13491/j.issn.1004-714x.2019.06.002.
HOU Dianjun, MA Ya, LI Jieqing, MAO Xuesong, ZHU Wei. Ionizing radiation induced miRNA-150 changes in peripheral blood[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2019, 28(6): 606-608, 613. DOI: 10.13491/j.issn.1004-714x.2019.06.002.

基金项目

山东省医学科学院医药卫生科技创新工程（2017-12-A）

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收稿日期：2019-06-18
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电离辐射诱发人外周血miRNA-150表达水平的改变及意义
侯殿俊 , 马娅 , 李洁清 , 毛雪松 , 朱伟     
山东省医学科学院放射医学研究所 山东第一医科大学, 山东 济南 250062
收稿日期：2019-06-18
基金项目：山东省医学科学院医药卫生科技创新工程（2017-12-A）
作者简介：侯殿俊(1966-), 女, 山东济南人, 副研究员, 研究方向:辐射生物效应。E-mail:houdianjun2002@126.com.
摘要：目的 通过实时定量PCR技术检测不同剂量照射引起人外周血miRNA-150表达的差异，从而探讨miRNA-150在机体辐射损伤中的意义。方法 将采集的静脉血分别给予0.5、1、2、4、8 Gy剂量照射，并设置对照组。照射后将血样接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养瓶中，置于37℃恒温培养箱中培养，利用实时定量PCR技术检测照射8、24 h后miR-150的含量变化；采用tbools软件进行miR-150序列比对，Starbase数据库预测miR-150靶基因。结果 miR-150在0.5、1、2、4、8 Gy照射后8 h后2-△△Ct值分别为0.66、0.68、0.74、0.75、0.63，与未照射组相比，差异有统计学意义；照射24 h后2-△△Ct值分别为0.94、0.95、0.71、0.59、0.67，较8 h均出现了不同程度的表达下调，与未照射组相比，差异有统计学意义；人与小鼠miR-150-5p序列一致，miR-150-3p种子序列区存在单一碱基差异，靶基因预测表明BASP1、MAP3K12和ZBTB4基因为人miR-150靶向基因的可能性最高。结论 照射后外周血中miR-150差异表达与辐射损伤有关，可成为预测辐射损伤的潜在生物标志物。
关键词：电离辐射    miRNA-150    生物标志物    电离辐射    辐射损伤    
Ionizing radiation induced miRNA-150 changes in peripheral blood
HOU Dianjun , MA Ya , LI Jieqing , MAO Xuesong , ZHU Wei     
Institute of Radiation Medicine Shandong Academy of Medical Sciences Shandong First Medical University, Jinan 250062 China
Abstract: Objective To study the differential regulations of miRNA-150 in human peripheral blood after ionizing radiation. Methods Venous blood was collected and exposed to 0.5 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy、8 Gy X-ray and set a control group at the same time. Blood samples were inoculated in culture bottles containing 10% calf serum and cultured in 37℃ incubators after radiation.miRNA-150 changes were detected after 8 and 24 hours post radiation by PCR. Sequence alignment for miRNA150 use tbools software. Predict the target gene of miRNA150 use Starbase datebase. Results After 8 h with 0.5 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy、8 Gy radiation, miRNA-150 expression levels were 0.66、0.68、0.74、0.75、0.63, compared with the unirradiated group, the results were statistically significant; miRNA-150 expression levels were 0.94、0.95、0.71、0.59、0.67 after 24 h, the expression was downregulated compared to 8 h, compared with the unirradiated group, the results were statistically significant. Human and mouse have the same sequence in miRNA-150-5p. There is a single base difference in the Seed sequence region of miRNA-150-3p. The target gene prediction shows that there is a highest probability of BASP1, MAP3K12 and ZBTB4 as the target genes of miRNA-150 for human. Conclusion The expression of miRNA-150 in peripheral blood after radiation is related to radiation injury and has a potential serum marker for radiation injury.
Key words: miRNA-150    Biomarkers    Ionizing Radiation    Radiation Damage    

microRNA是一类广泛存在于真核生物中的长度约为19~25个核苷酸的非编码单链RNA分子。有研究认为[1]miRNA可作为一种基因转录后调节因子作用于DNA损伤相关基因，参与调节辐射后DNA损伤，这提示着miRNA可作为一种辐射生物标志物预测辐射损伤。miR-150是一个长度为22个核苷酸的定位于人类染色体19q13.33的单链小分子RNA，通过遏制靶基因的翻译从而抑制其作用[2]。本研究拟采用实时定量PCR方法，检测不同剂量照射人外周血后miR-150表达水平的变化，探究miR-150与辐射损伤的关系。

1 材料与方法 1.1 研究对象

在签署知情同意书的前提下，选取5例非放射性工作人员、半年内无射线照射史的健康志愿者为供血者，其中2名男性, 3名女性，年龄为22~28岁。每人采集静脉血50 ml，分装于10只EDTA-K2真空抗凝管内备用。

1.2 照射条件和培养

采用医用电子直线加速器室温下照射血样，剂量分别为0、0.5、1、2、4、8 Gy。将照射后的血样分别接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养瓶中，置于37℃恒温培养箱中培养，于照射后第8 h、24 h收获细胞，并在各时间点均设置对照组。

1.3 实验材料及方法 1.3.1 实验试剂及仪器

TRNzol：天根生化科技(北京)有限公司，反转录试剂盒(TaKaRa, PrimeScript RTreagent kit with gDNA Eraser)，qPCR mix(SYBR Green qPCR Master Mix (2×), with ROX，依科赛)，qPCR 96孔板(罗氏)，荧光定量PCR仪(罗氏480II)，PCR仪(依科赛IT041-0002)，超纯水仪(Millipor synergy)，超微量分光光度计(依科赛MINIDROP)。

1.3.2 全血总RNA的分离提取

在照射后0、8、24 h分别收集标本，严格按照血液总RNA提取试剂的说明书操作步骤进行，运用超微量分光光度计对RNA浓度进行测定，鉴定RNA的提取质量。血液总RNA的提取采用天根生化科技有限公司提取试剂盒。

1.3.3 反转录及qPCR

按照反转录试剂盒(TaKaRa, PrimeScript RTreagent kit with gDNA Eraser)操作说明，将得到的RNA样品溶于20 μl无RNA酶的水中，反转录为cDNA。本研究的目的基因为miR-150-3p，所选内参基因为U6基因。miR-150基因全序列来自Gene Bank，实时荧光定量PCR的引物序列购自公司(保密)。

1.4 生物信息学分析miR-150同源性与靶基因

采用mirbase数据库(http://www.mirbase.org/)获取人与小鼠的成熟miR-150序列，通过tbtools软件分别对其序列进行对比。通过采用StarBase v2.0数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/)分别预测出人hsa-mir-150-5p和小鼠mmu-mir-150-5p的靶基因，采用cytoscape3.6.1软件对靶基因进行网络可视化分析。

1.5 统计学处理

应用软件SPSS 17.0版进行统计分析，采用t检验，认为P＜0.05有统计学差异。

2 结果 2.1 不同剂量照射后8 h外周血miRNA-150的表达变化

见表 1, 分别给予0.5、1、2、4、8 Gy剂量照射，8 h后外周血中miR-150出现了不同程度的下调(P < 0.05)。

表 1 同剂量照射后8 h miR-150的表达变化

见表 2, 分别给予0.5、1、2、4、8 Gy剂量照射后，培养24 h，外周血中miR-150均出现了不同程度的下调(P < 0.05)。

表 2 不同剂量照射后24 h miR-150的表达变化

图 1 不同剂量照射8、24 h后人外周血中miR-150的表达水平

在0.5、1、2、4、8 Gy剂量照射后8 h、24 h miR-150均出现了不同程度的表达下调，且和对照组相比P < 0.05，差异均具有统计学意义。

2.2 miR-150同源性及靶基因

序列比对结果表人与小鼠miR-150-5p序列完全一致，人与小鼠miR-150-3p序列相对保守，种子序列存在单一碱基差异(图 2)。靶基因预测表明其中人hsa-mir-150-5p靶基因共有100 1个，小鼠mmu-mir-150-5p的靶基因共有202个。人hsa-mir-150-5p靶基因中BASP1、MAP3K12和ZBTB4为5个预测软件所共有，其作为miR-150的潜在靶基因可能性高。图 3采用两个以上Starbase中支持2个以上数据库共有的为人和小鼠mir-150-5p的靶基因预测结果，其中，人与小鼠没有共有的靶基因。

图 2 人与小鼠miR-150同源性分析

图 3 人与小鼠miR-150靶基因(A：人B:小鼠)预测
3 讨论

随着核能及核技术的广泛应用，公众受到电离辐射暴露的几率增加。核辐射事故后对受照人员受照剂量的估算是进行早期分类诊断、迅速处置放射事故、制定医学救治方案及判断预后的最重要环节，因此，研究测量不同照射情况的生物剂量计成为亟需解决的问题。

miRNA广泛存在于多种真核生物中，具有高度保守性、时序性、组织特异性和稳定性的特点，在细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中起重要作用[3-5]。近年来许多学者致力于研究miRNA在电离辐射损伤中的作用。Thomas[6]等利用0.5、1.5和5 Gy的γ射线照射小鼠，结果显示照后6 h和24 h血液中microRNA-680和microRNA-685的表达变化显著。Cui[7]等采用0.5 Gy、2 Gy和10 Gy的137Cs γ射线照射(剂量率为52 cGy/min)小鼠，发现照射6 h及24 h后，其血浆miRNA表达谱发生明显变化，其变化具有时间和剂量依赖性。李刚强[8]等采用0.5、2、6、10 Gy照射小鼠，观察到6 h和24 h后miRNA表达异常且与未照射组比较，表达差异有统计学意义。有27个miRNA表达谱，对辐射损伤剂量和时间的判断有很好的效果，准确率、敏感性和特异性均90 %以上。另有有研究者Jacob[9]等采用1~12 Gy射线照射小鼠，不但发现miR-150表达下调，且发现其存在很好的剂量—效应关系。因此外周血液中miR-150差异表达有望成为一种新型的检测辐射损伤的生物标志物。由于目前的结论大多基于细胞或动物模型得出，本实验着重探讨了离体人外周血经不同剂量照射后miR-150表达的情况。

抽取健康人外周血在经过不同剂量照射后，观察到8、24 h miR-150的表达均出现了不同程度的下调，这与以往的动物实验结果是相似的，提示照射后外周血液中miR-150差异表达与辐射损伤有关。但是在实验中我们也发现外周血照射后miR-150的表达剂量效应依懒性并不明显，我们分析一方面由于样本量的限制，未来仍需收集更多的血清学资料以验证miR-150与辐射损伤的关系，更重要的是由于miR-150主要在于人体的心肌、脾脏、胸腔中表达，离体的外周血并不能完全表达活体血液中的miR-150的变化，后期我们需要动物实验来进一步佐证。

miRNA主要通过抑制其靶基因来起到调控作用，而miRNA靶基因参与细胞增殖、生长、发育、分化与凋亡等诸多生物学过程。miRNA的表达具有时空特异性与组织特异性。本文研究表明miR-150与辐射损伤具有相关性，进一步需解决的问题是miR-150表达量的变化具体会影响到哪些靶基因的表达变化，而靶基因的变化是否与miR-150的表达存在负相关，它们是否也参与到辐射损伤调控中，miR-150参与辐射损伤的具体作用机制等尚有待于进一步深入研究。

参考文献
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