中国辐射卫生  2019, Vol. 28 Issue (3): 223-227  DOI: 10.13491/j.issn.1004-714x.2019.03.001

引用本文 

李梅, 刘梦雅, 王新钢, 黄立群, 孙鸽, 尹晶晶, 秦秀军. NHEJ通路相关基因在电离辐射所致脑损伤中的表达情况研究[J]. 中国辐射卫生, 2019, 28(3): 223-227. DOI: 10.13491/j.issn.1004-714x.2019.03.001.
LI Mei, LIU Mengya, WANG Xingang, HUANG Liqun, SUN Ge, YIN Jingjing, QIN Xiujun. Research of expression of NHEJ pathway related genes in brain injury induced by ionizing radiation[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2019, 28(3): 223-227. DOI: 10.13491/j.issn.1004-714x.2019.03.001.

基金项目

山西省自然科学基金(201801D121363);山西省科技基础条件平台项目(201805D141007)

通讯作者

秦秀军, E-mail:qxj19982000@163.com

文章历史

收稿日期:2018-12-11
NHEJ通路相关基因在电离辐射所致脑损伤中的表达情况研究
李梅 , 刘梦雅 , 王新钢 , 黄立群 , 孙鸽 , 尹晶晶 , 秦秀军     
中国辐射防护研究院放射医学与环境医学研究所, 山西 太原 030006
摘要目的 通过对大鼠头部进行不同剂量的照射,研究NHEJ通路相关基因在电离辐射所致脑损伤中的表达情况。方法 利用医用电子加速器装置对SD大鼠分别进行10 Gy、20 Gy、30 Gy的照射,并于照后30天提取动物海马组织中的总RNA;30 Gy照射组在照后6 h、24 h、72 h、7天、30天五个不同时间点提取动物海马组织中的总RNA。使用实时荧光定量PCR技术对NHEJ通路中的XRCC4、XRCC5和XRCC6基因的表达情况进行研究。结果 经照射大鼠海马组织中与DNA修复相关的基因XRCC4、XRCC5和XRCC6表达均有所上调;20 Gy组XRCC4、XRCC5和XRCC6基因的表达量较10 Gy和30 Gy组高;XRCC4基因在照后7天表达量达到最高,而XRCC5和XRCC6基因在照后6 h达到最高,XRCC4、XRCC5和XRCC6基因表达量均在照后30天达到最低。结论 通过本项目研究发现NHEJ通路中与DNA损伤修复有关基因XRCC4、XRCC5、XRCC6在电离辐射所致脑损伤照射不同剂量点及照后不同时间点均上调表达,说明在10、20、30 Gy照射和电离辐射后6 h、24 h、72 h、7天、30天五个不同时间点机体均通过NHEJ通路进行DNA双链修复,且在照后6h和第7天修复能力最强。
关键词电离辐射    XRCC4基因    XRCC5基因    XRCC6基因    DNA双链断裂修复    实时荧光定量PCR    
Research of expression of NHEJ pathway related genes in brain injury induced by ionizing radiation
LI Mei , LIU Mengya , WANG Xingang , HUANG Liqun , SUN Ge , YIN Jingjing , QIN Xiujun     
Department of Radiological and Evironmental Medicine, China Institute for Radiation Protection, Taiyuan 030006 China
Abstract: Objective To study the expression of the genes associated with the NHEJ pathway in brain injury induced by ionizing radiation on the head of rats at different doses. Methods Using medical electron accelerator to irradiate on SD rats at doses of 10Gy, 20 Gy and 30 Gy, and the total RNA in animal hippocampus tissue was extracted 30 days after exposure. The RNA of 30Gy irradiation group was extracted in 6 h, 24 h, 72 h, 7 d and 30 d after exposure. The expression of XRCC4, XRCC5 and XRCC6 genes in the NHEJ pathway wasstudied using real-time fluorescence quantitative PCR. Results The expression of genes XRCC4, XRCC5 and XRCC6 associated with DNA repair in irradiated rat hippocampus wasup-regulated. The expression levels of the genes XRCC4, XRCC5 and XRCC6 in the 20 Gy group were higher than those in 10 Gy and 30 Gy groups; The expression of XRCC4 reached the highest level 7 days after exposure, while the expression of XRCC5 and XRCC6 genes reached the highest level 6h after exposure, and the expression levels of XRCC4, XRCC5 and XRCC6 genes reached the lowest level 30 days after exposure. Conclusion The expression of genes XRCC4, XRCC5 and XRCC6 associated with DNA damage repair in the NHEJ pathway at different dose points and at different timepoints after exposure to brain injury caused by radiation was found to be raised. It indicated that the body repaired DNA double strand through NHEJ pathway at 6 h, 24 h, 72 h, 7 days and 30 days after 10, 20, 30 Gy irradiation and the most powerful repair ability was performed at 6 h and 7 days after exposure.
Key words: Radiation    XRCC4 Gene    XRCC5 Gene    XRCC6 Gene    DNA Double Strand Fracture Repair    Real-Time Fluorescence Quantitative PCR    

随着科技的发展和对电离辐射应用的深入研究,放疗已经成为肿瘤患者治疗的重要手段,DNA是电离辐射重要的靶分子之一,电离辐射可引起DNA链断裂,放疗就是通过将能量直接沉积于肿瘤细胞DNA分子上,使其断裂,从而诱导细胞凋亡,达到治疗的目的。但在治疗的过程中也会对辐照部位周围的正常组织造成损伤,其中放射性脑坏死、神经认知功能障碍、颅神经及其他周围神经损伤等神经系统损伤最为常见,这严重影响了患者日后的生存质量[1]。非同源性内部连接通路(non-homologous end-joining, NHEJ)是DNA双链断裂修复的主要方式之一。X射线修复交叉互补基因(X ray repair cross complementing genes, XRCC)是DNA损伤修复过程中参与的一组重要的基因,其中XRCC4、XRCC5和XRCC6基因主要参与NHEJ通路DNA双链的修复过程,其表达量直接影响DNA双链的修复能力[2-4]。本实验通过实时荧光定量PCR技术检测不同剂量照射以及辐照后不同时间点XRCC4、XRCC5和XRCC6基因的相对表达量,探究其表达量的变化情况。

1 材料与方法 1.1 实验动物

SPF级5~6周龄雄性SD大鼠, 中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,生产许可证号: SCXK-(军) 2012-0004,合格证号: 0035516;动物饲养管理于中国辐射防护研究院实验动物中心,使用许可证号: SYXK(晋) 2013-0002。

1.2 试剂及仪器

柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒(Sangon Biotech(Shanghai));PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara Bio Inc);SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara Bio Inc)。LightCycler480型PCR仪(德国Roche Diagnostics Ltd)

1.3 辐照源

山西大医院放疗科直线加速器, 型号Elekta Synergy,英国Elekta Limited生产,照射剂量率:3 Gy/min。

1.4 动物分组及照射

SD大鼠经一周检疫后,按照体重随机分成对照组(0 Gy)、10 Gy、20 Gy和30 Gy照射组,30 Gy照射组根据不同时间点,依次为6 h、24 h、72 h、7天、30天,分为5个组。经10%的水合氯醛麻醉后摆位固定,利用6 MeV直线加速器对脑部进行照射, 剂量率为3 Gy/min,源距为1.0 m。

1.5 大鼠海马总RNA提取

分别在照后6 h、24 h、72 h、7天、30天将大鼠麻醉后剖杀取海马,按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书步骤要求,抽提海马样品中的总RNA,并取2μL在蛋白核酸测定仪检测其浓度与纯度,其余置于-80 ℃冻存备用。

1.6 mRNA表达水平的检测

采用RT-PCR法检测XRCC4、XRCC5和XRCC6基因的表达水平,采用生工生物工程股份有限公司设计合成的引物(表 1),以管家基因(β-actin)作为内参,将四个组动物提取的总RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板,进行RT-PCR反应。

表 1 扩增基因的引物序列

逆转录反应条件为:将总RNA 10 μL和逆转录混合液10 μL混匀成20 μL的反应体系,放入PCR仪,经37℃反应15 min,85℃反应5s后终止反应,逆转录完成。PCR反应条件为:以2 μL cDNA为模板,混合液10 μL,上下游引物各0.8 μL,双蒸水6.4 μL混匀形成20 μL的反应体系进行PCR反应,经95℃,30 s预变性;95℃变性5 s;60℃退火和延伸20 s;40个循环,每个样品做三次重复。

1.7 样品归一化处理

以β-actin为参比基因,对所有样品进行归一化处理,实验结果用LightCycler480版软件分析。采用“2-△△Ct”相对定量法计算大鼠海马XRCC4、XRCC5和XRCC6的相对表达量。

1.8 数据处理

所有数据用SPSS 16.0统计分析软件进行分析,全部数据均以均数±标准差(means±SD)的形式表示,多组间均数比较采用单因素ANOVA方差分析。当P < 0.05认为有统计学差异。

2 结果 2.1 溶解曲线和扩增曲线

目的基因XRCC4、XRCC5、XRCC6和β-actin的溶解曲线见图 1。溶解曲线显示,XRCC4、XRCC5、XRCC6基因为单一峰,表明基因扩增均为特异性扩增。图 2显示的为XRCC4、XRCC5、XRCC6和β-actin基因的扩增曲线。

图 1 XRCC4、XRCC5、XRCC6和β-actin实时荧光定量PCR的溶解曲线(温度-荧光信号值)

图 2 XRCC4、XRCC5、和XRCC6的实时荧光定量PCR的扩增曲线
2.2 不同照射剂量对XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达的影响

表 2图 3所示为不同剂量组XRCC4、XRCC5、XRCC6基因实时荧光定量PCR定量比值结果,照射组中XRCC4、XRCC5、XRCC6基因与β-actin的Ct值所算出的相对表达量与对照组的表达量相比较, 以对照组的表达量作为1,处理组与对照组的比值大于1为上调,小于1为下调,从表 2图 3中可以看出在照后一个月的三个剂量照射组中,XRCC4、XRCC5、XRCC6基因的表达都有所上调(定量比值>1),且20 Gy表达量略高于10 Gy和30 Gy,说明30天后仍在进行修复,但不同剂量之间无明显差异(P>0.05)。

表 2 XRCC4、XRCC5、XRCC6基因不同剂量实时荧光定量PCR定量比值

图 3 XRCC4、XRCC5、XRCC6基因不同剂量实时荧光定量PCR定量比值
2.3 照射后不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达变化情况

表 3图 4所示为不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因实时荧光定量PCR定量比值结果。从表 3图 4中可以看出,30 Gy照射后6 h、24 h、72 h、7天、30天五个不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因均上调表达。XRCC4基因在照后第7天表达量达到最高,与其余4个时间点基因表达量比较均有统计学差异(P<0.05);XRCC5和XRCC6基因在照后6 h表达量达到最高,其中XRCC5基因与照后6h表达量相比,照后30天表达差异具有统计学意义(P<0.05),XRCC6基因与照后6 h表达量相比,其余4个时间点表达差异均有统计学意义(P < 0.05)。

表 3 XRCC4、XRCC5、XRCC6基因不同时间点实时荧光定量PCR定量比值

图 4 XRCC4、XRCC5、XRCC6基因不同时间点实时荧光定量PCR定量比值 注:*XRCC4:与7 d相比P<0.05;XRCC5:与6 h相比P<0.05;XRCC6:与6 h相比P<0.05。
3 讨论

近年来随着医学影像技术的发展,电离辐射在医疗领域得到广泛的应用,在给人类诊断治疗疾病带来极大利益的同时,也带来了人们共同关注的辐射危害。目前放射诊疗活动在很多基层医疗机构不断增加,基于基层医疗机构的规模和医疗条件,其防护及管理方面呈现出很多问题[5-6]。射线照射后机体可产生自由基。氧自由基攻击细胞膜中生成的丙二醛(MDA), 其能够攻击生物膜,可引起细胞损伤,进一步造成DNA链断裂、染色体畸变、早衰和生命缩短等现象[7]。电离辐射所致DNA损伤主要包括DNA链断裂、DNA交联以及DNA二级、三级结构变化。而机体自身针对DNA损伤具有相应的自我修复机制,其中DNA双链断裂(DSB)主要通过同源重组与非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)两条途径进行修复[8],其中通过NHEJ信号通路修复途径不要求DNA断裂末端的序列具有同源性[2, 6],可以直接连接两个断裂的末端[10],是DSB的主要修复途径。在DSBs发生后,NHEJ主要通过以下过程来进行DNA双链的修复工作:首先异源体KU识别DSB位点并与DNA残留末端连接来保护被核酸酶切断的游离的DNA位点,其中KU是由Ku80蛋白和Ku70蛋白组成,而Ku80蛋白和Ku70蛋白分别由XRCC5基因和XRCC6基因编码;之后,DNA-PKcs,XRCC4/LIG4,聚集并活化DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK);最后,两个断端可直接连接来修复断裂的DNA双链[3, 9, 11]。由此可见XRCC4、XRCC5、XRCC6基因作为NHEJ通路的关键基因,其表达水平的高低可以直接影响NHEJ信号通路的功能[12]

本次研究针对电离辐射致脑损伤NHEJ通路中与DNA损伤修复有关基因表达变化情况,结果显示,在不同照射剂量中,20 Gy组XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达量最高,说明20 Gy达到了机体的最大修复能力,此结果与Li-Yuan ZHANG[9]的报道相一致。照射后不同时间点(照射后6 h、24 h、72 h、7天、30天)XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达变化情况的研究中,由于单次30 Gy全脑照射可以成功诱导大鼠的急性认知功能障碍[13],造成电离辐射脑损伤,故我们采用了30 Gy对大鼠头部进行照射,并对不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达量进行检测,结果显示,XRCC5和XRCC6基因表达量在照后6h达最高,而XRCC4基因表达量在照后7天时达到最高,说明在照后6 h,经过大剂量照射发生大量的DNA双链断裂损伤,需要及时修复,XRCC5基因和XRCC6基因对DNA断裂位点进行识别,故此时XRCC5和XRCC6基因的表达量达到最高,随后在照射后第7天XRCC4参与聚集并活化DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)对DNA双链进行修复,提示完成电离辐射致脑损伤急性损伤后断裂的DNA双链修复过程。

参考文献
[1]
姜群群, 唐荣华. 放射治疗所致神经系统损伤[J]. 神经损伤与功能重建, 2014, 9(6): 522-525. DOI:10.3870/sjsscj.2014.06.021
[2]
邱宇凡, 胡蕴慧, 张瑾. DNA同源重组修复与乳腺癌的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(7): 910-914. DOI:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.07.006
[3]
王芹, 岳井银, 李进, 等. γ射线照射后小鼠XRCC修复基因的mRNA表达[J]. 中国辐射卫生, 2006, 15(1): 1-2. DOI:10.3969/j.issn.1004-714X.2006.01.001
[4]
范雪娇, 任朋亮, 卢钟娇, 等. DNA损伤修复基因XRCC4、RAD51单核苷酸多态性与中国地区食管癌易感相关性研究[J]. 四川大学学报(医学版), 2013, 44(4): 568-572.
[5]
曾运良, 江石丰, 程晋鹏, 等. 惠州市乡镇卫生院放射防护现状调查[J]. 中国辐射卫生, 2015, 24(4): 333-335.
[6]
朱进平, 顾群, 杨斌, 等. 泰兴市医疗机构放射卫生管理现状分析与策略讨论[J]. 中国辐射卫生, 2015, 24(6): 591-593.
[7]
毕良文, 段伟, 王晓莉, 等. 中药辐射防护剂的研究进展[J]. 中国辐射卫生, 2006, 15(1): 118-120. DOI:10.3969/j.issn.1004-714X.2006.01.071
[8]
周平坤. DNA修复—基因组稳定性护卫机制的原创与发现之旅[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2016, 32(1): 1-9.
[9]
Zhang LY, Chen LS, Sun R, et al. Effects of expression level of DNA repair-related genes involved in the NHEJ pathway on radiation-induced cognitive impairment[J]. Journal of Radiation Research, 2013, 54: 235-242. DOI:10.1093/jrr/rrs095
[10]
孟荣荣, 应明真, 王雅杰. NHEJ途径修复DSB的研究进展[J]. 医学研究杂志, 2013, 42(1): 7-10. DOI:10.3969/j.issn.1673-548X.2013.01.004
[11]
Zhang ZH, Hu Wl. A single nucleotide polymorphism in XRCC4 gene is associated with reduced colorectal cancer susceptibility in female[J]. Journal of Medical Colleges of PLA, 2011, 86: 85-93.
[12]
许义松, 周文静, 祁晓丽, 等. NHEJ信号通路关键基因mRNA表达与宫颈鳞癌同步放化疗敏感性的关系[J]. 西北大学学报, 2015, 45(5): 781-786.
[13]
Ji SJ, Tian Y, Lu Y, et al. Irradiation-induced hippocampal neurogenesis impairment is associated with epigenetic regulation of bdnf gene transcription[J]. Brain Research, 2014, 577: 77-88.