随着科技的发展和对电离辐射应用的深入研究，放疗已经成为肿瘤患者治疗的重要手段，DNA是电离辐射重要的靶分子之一，电离辐射可引起DNA链断裂，放疗就是通过将能量直接沉积于肿瘤细胞DNA分子上，使其断裂，从而诱导细胞凋亡，达到治疗的目的。但在治疗的过程中也会对辐照部位周围的正常组织造成损伤，其中放射性脑坏死、神经认知功能障碍、颅神经及其他周围神经损伤等神经系统损伤最为常见，这严重影响了患者日后的生存质量^[1]。非同源性内部连接通路(non-homologous end-joining, NHEJ)是DNA双链断裂修复的主要方式之一。X射线修复交叉互补基因(X ray repair cross complementing genes, XRCC)是DNA损伤修复过程中参与的一组重要的基因，其中XRCC4、XRCC5和XRCC6基因主要参与NHEJ通路DNA双链的修复过程，其表达量直接影响DNA双链的修复能力^[2-4]。本实验通过实时荧光定量PCR技术检测不同剂量照射以及辐照后不同时间点XRCC4、XRCC5和XRCC6基因的相对表达量，探究其表达量的变化情况。

1 材料与方法 1.1 实验动物

SPF级5~6周龄雄性SD大鼠, 中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号: SCXK-(军) 2012-0004，合格证号: 0035516;动物饲养管理于中国辐射防护研究院实验动物中心，使用许可证号: SYXK(晋) 2013-0002。

1.2 试剂及仪器

柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒(Sangon Biotech(Shanghai))；PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara Bio Inc)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara Bio Inc)。LightCycler480型PCR仪(德国Roche Diagnostics Ltd)

1.3 辐照源

山西大医院放疗科直线加速器, 型号Elekta Synergy，英国Elekta Limited生产，照射剂量率：3 Gy/min。

1.4 动物分组及照射

SD大鼠经一周检疫后，按照体重随机分成对照组(0 Gy)、10 Gy、20 Gy和30 Gy照射组，30 Gy照射组根据不同时间点，依次为6 h、24 h、72 h、7天、30天，分为5个组。经10%的水合氯醛麻醉后摆位固定，利用6 MeV直线加速器对脑部进行照射, 剂量率为3 Gy/min，源距为1.0 m。

1.5 大鼠海马总RNA提取

分别在照后6 h、24 h、72 h、7天、30天将大鼠麻醉后剖杀取海马，按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书步骤要求，抽提海马样品中的总RNA，并取2μL在蛋白核酸测定仪检测其浓度与纯度，其余置于-80 ℃冻存备用。

1.6 mRNA表达水平的检测

采用RT-PCR法检测XRCC4、XRCC5和XRCC6基因的表达水平，采用生工生物工程股份有限公司设计合成的引物(表 1)，以管家基因(β-actin)作为内参，将四个组动物提取的总RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板，进行RT-PCR反应。

逆转录反应条件为：将总RNA 10 μL和逆转录混合液10 μL混匀成20 μL的反应体系，放入PCR仪，经37℃反应15 min，85℃反应5s后终止反应，逆转录完成。PCR反应条件为：以2 μL cDNA为模板，混合液10 μL，上下游引物各0.8 μL，双蒸水6.4 μL混匀形成20 μL的反应体系进行PCR反应，经95℃，30 s预变性；95℃变性5 s；60℃退火和延伸20 s；40个循环，每个样品做三次重复。

1.7 样品归一化处理

以β-actin为参比基因，对所有样品进行归一化处理，实验结果用LightCycler480版软件分析。采用“2^-△△Ct”相对定量法计算大鼠海马XRCC4、XRCC5和XRCC6的相对表达量。

1.8 数据处理

所有数据用SPSS 16.0统计分析软件进行分析，全部数据均以均数±标准差(means±SD)的形式表示，多组间均数比较采用单因素ANOVA方差分析。当P < 0.05认为有统计学差异。

2 结果 2.1 溶解曲线和扩增曲线

目的基因XRCC4、XRCC5、XRCC6和β-actin的溶解曲线见图 1。溶解曲线显示，XRCC4、XRCC5、XRCC6基因为单一峰，表明基因扩增均为特异性扩增。图 2显示的为XRCC4、XRCC5、XRCC6和β-actin基因的扩增曲线。

2.2 不同照射剂量对XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达的影响

表 2和图 3所示为不同剂量组XRCC4、XRCC5、XRCC6基因实时荧光定量PCR定量比值结果，照射组中XRCC4、XRCC5、XRCC6基因与β-actin的Ct值所算出的相对表达量与对照组的表达量相比较, 以对照组的表达量作为1，处理组与对照组的比值大于1为上调，小于1为下调，从表 2和图 3中可以看出在照后一个月的三个剂量照射组中，XRCC4、XRCC5、XRCC6基因的表达都有所上调(定量比值＞1)，且20 Gy表达量略高于10 Gy和30 Gy，说明30天后仍在进行修复，但不同剂量之间无明显差异(P＞0.05)。

2.3 照射后不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达变化情况

表 3和图 4所示为不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因实时荧光定量PCR定量比值结果。从表 3和图 4中可以看出，30 Gy照射后6 h、24 h、72 h、7天、30天五个不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因均上调表达。XRCC4基因在照后第7天表达量达到最高，与其余4个时间点基因表达量比较均有统计学差异(P＜0.05)；XRCC5和XRCC6基因在照后6 h表达量达到最高，其中XRCC5基因与照后6h表达量相比，照后30天表达差异具有统计学意义(P＜0.05)，XRCC6基因与照后6 h表达量相比，其余4个时间点表达差异均有统计学意义(P < 0.05)。

3 讨论

近年来随着医学影像技术的发展，电离辐射在医疗领域得到广泛的应用，在给人类诊断治疗疾病带来极大利益的同时，也带来了人们共同关注的辐射危害。目前放射诊疗活动在很多基层医疗机构不断增加，基于基层医疗机构的规模和医疗条件，其防护及管理方面呈现出很多问题^[5-6]。射线照射后机体可产生自由基。氧自由基攻击细胞膜中生成的丙二醛(MDA), 其能够攻击生物膜，可引起细胞损伤，进一步造成DNA链断裂、染色体畸变、早衰和生命缩短等现象^[7]。电离辐射所致DNA损伤主要包括DNA链断裂、DNA交联以及DNA二级、三级结构变化。而机体自身针对DNA损伤具有相应的自我修复机制，其中DNA双链断裂(DSB)主要通过同源重组与非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)两条途径进行修复^[8]，其中通过NHEJ信号通路修复途径不要求DNA断裂末端的序列具有同源性^{[2, 6]}，可以直接连接两个断裂的末端^[10]，是DSB的主要修复途径。在DSBs发生后，NHEJ主要通过以下过程来进行DNA双链的修复工作：首先异源体KU识别DSB位点并与DNA残留末端连接来保护被核酸酶切断的游离的DNA位点，其中KU是由Ku80蛋白和Ku70蛋白组成，而Ku80蛋白和Ku70蛋白分别由XRCC5基因和XRCC6基因编码；之后，DNA-PKcs，XRCC4/LIG4，聚集并活化DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)；最后，两个断端可直接连接来修复断裂的DNA双链^{[3, 9, 11]}。由此可见XRCC4、XRCC5、XRCC6基因作为NHEJ通路的关键基因，其表达水平的高低可以直接影响NHEJ信号通路的功能^[12]。

本次研究针对电离辐射致脑损伤NHEJ通路中与DNA损伤修复有关基因表达变化情况，结果显示，在不同照射剂量中，20 Gy组XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达量最高，说明20 Gy达到了机体的最大修复能力，此结果与Li-Yuan ZHANG^[9]的报道相一致。照射后不同时间点(照射后6 h、24 h、72 h、7天、30天)XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达变化情况的研究中，由于单次30 Gy全脑照射可以成功诱导大鼠的急性认知功能障碍^[13]，造成电离辐射脑损伤，故我们采用了30 Gy对大鼠头部进行照射，并对不同时间点XRCC4、XRCC5、XRCC6基因表达量进行检测，结果显示，XRCC5和XRCC6基因表达量在照后6h达最高，而XRCC4基因表达量在照后7天时达到最高，说明在照后6 h，经过大剂量照射发生大量的DNA双链断裂损伤，需要及时修复，XRCC5基因和XRCC6基因对DNA断裂位点进行识别，故此时XRCC5和XRCC6基因的表达量达到最高，随后在照射后第7天XRCC4参与聚集并活化DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)对DNA双链进行修复，提示完成电离辐射致脑损伤急性损伤后断裂的DNA双链修复过程。