氧化法是蛋白质放射性碘标记的常用方法，而Iodogen(四氯二苯基甘尿)则是氧化法中常用的氧化剂。为研究¹³¹I-纤维蛋白原在体内的留滞时间，我们以Iodogen为氧化剂，对纤维蛋白原进行了¹³¹I标记。

我们采用了一步标记法，与高云朝等^[1]人的小剂量氧化剂多次标记流程相比，在获得满意的标记率及生物活性率的前提下，我们的方法更加简单、可靠。

1 实验材料及方法 1.1 实验材料

纤维蛋白原(Ruibio)、Iodogen(sigma)、无载体Na¹³¹I溶液(原子高科股份有限公司)、冰醋酸(分析纯)，凝血酶(福建华灿制药有限公司)、氯化钙、新华1号层析滤纸(杭州沃华滤纸有限公司)；放射性活度计(RM905a，中国计量科学研究院)、核素扫描仪(NSC-350，中佳光电)、γ放射免疫计数器(SN-695，上海日环光电仪器有限公司)。

1.2 实验方法 1.2.1 Iodogen涂管制备

定量移取5 μg、10 μg和20 μg的30 μl Iodogen二氯甲烷溶液于0.5 ml具塞塑料试管中，负压抽干溶剂二氯甲烷，即得5、10及20 μg的Iodogen涂管，-20℃保存备用。

1.2.2 标记率测定方法

以10%冰醋酸溶液为展开剂，以新华1号层析滤纸为载体，对待测样品进行色谱分析。层析后纤维蛋白原留在原点，游离¹³¹I则移动到前沿。测定原点放射性计数C_o及整个层析条放射性计数C_t，则标记率按下面公式计算：

$ 标记率 = {{\rm{C}}_0}/{{\rm{C}}_{\rm{t}}} \times 100\% $

1.2.3 纤维蛋白原生物活性率测定

移取50 μl标记液于0.5 ml塑料试管中，加入50 μl凝血酶溶液(1 mg凝血酶/ml 1%氯化钙水溶液)，室温静置10 min，加入200 μl生理盐水，离心3000转，5 min。测量总放射性计数得C_t，吸出液体，再加入200 μl生理盐水洗涤贴壁的纤维蛋白，吸出液体，测量试管中纤维蛋白的放射性计数C_d。生物活性率按下面公式计算：

$ 生物活性率 = {{\rm{C}}_{\rm{d}}}/({{\rm{C}}_{\rm{t}}} \times 标记率) \times 100\% $

1.2.4 氧化标记

依次将100 μl纤维蛋白原水溶液(10 mg/ml)及Na¹³¹I水溶液(约3.7×10⁶Bq)移入不同剂量的Iodogen涂管；室温反应20 min，取样测定标记率。依次将100 μl纤维蛋白原水溶液(10 mg/ml)及Na¹³¹I水溶液(约3.7×10⁶Bq)移入10 μg Iodogen涂管中，室温反应，分别于5 min，15 min及30 min取样测定标记率及生物活性。

1.3 统计学方法

利用SPSS 21.0软件进行统计学分析。不同剂量Iodogen涂管后标记率的差异及不同反应时间生物活性率的差异比较采用方差分析，P值＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 纸层析分析标记率的测定采用了纸层析法

以10%冰醋酸为展开剂，3号层析滤纸为载体。将标记液展开后，利用核素扫描仪获得的¹³¹I分布图。标记在纤维蛋白原的¹³¹I留在原点，游离的¹³¹I则居于前沿。见图 1。

2.2 氧化标记

按前述标记流程进行氧化标记，在不同剂量涂管中依次加入纤维蛋白原水溶液及Na¹³¹I水溶液，反应20 min后测定标记率。见表 1。

在10 μg Iodogen涂管中依次加入纤维蛋白原水溶液及Na¹³¹I水溶液，不同反应时间取样测量，标记率及生物活性按前述方法计算。见表 2。

3 讨论

通过使用氧化剂或电解装置，可将碘离子氧化成碘原子。碘原子具有亲电性，可与蛋白质中组氨酸或络氨酸残基上的氢原子发生反应，取代氢原子而结合到蛋白质分子上。1964年，U.Rosa等^[2]人成功地利用电解法对纤维蛋白原进行了碘标记。由于电解法需要特殊装置，目前在蛋白质碘标记物制备中已很少使用。2000年，高云朝等人发表了利用Iodogen为氧化剂的纤维蛋白原¹²⁵I标记流程，采用的是小剂量氧化剂多次标记法，标记率及标记物生物活性率都在90%以上。但报告中所用标记率测试方法与众不同，是将标记物纯化后再测试，而不是测定标记物放射性占总放射性的比率^[3-4]，因此其结果不具参考价值。

我们采用的是以Iodogen为氧化剂的一步标记法，将氧化剂用量及反应时间控制在一定范围，即可获得满意的标记率及生物活性率。在标记反应中，3.7×10⁶ Bq(100 μCi)的¹³¹I的化学量是8.05 μg，若其与Iodogen发生的氧化还原反应摩尔比是1:1，则对应的Iodogen化学量为2.64 μg。我们使用的Iodogen量都属于超量，所以对标记率无明显影响。

另外，我们发现，使用新开封¹³¹I溶液时，可获得较高的标记率；随着开封后¹³¹I溶液放置时间增加，标记率会有所下降，这可能与¹³¹I溶液接触空气后，碘离子的存在状态发生了变化。纤维蛋白原溶液本身不稳定，很容易自凝聚，不能长期存放，因此我们未测试标记物的稳定性。为避免因溶液不稳定造成标记物变性，我们都是标记后随即使用。游离的¹³¹I在碘封闭甲状腺的实验动物体内清除迅速，不会影响我们对纤维蛋白原体内留滞时间的测定，所以我们未对标记产物进行纯化。

总之，以Iodogen为氧化剂，一步反应，即可获得纤维蛋白原碘标记物。标记率及生物活性率都接近90%。