2. 山东省医学科学院放射医学研究所
2. Institute of Radiation Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences
随着近年来核能的广泛应用以及核与辐射事故数量的日益增加，人们对生物剂量估算的需求愈以迫切。核与辐射事件发生后，必须及时根据受照剂量确定相应的医学应急处置，从而保证人员的生命安全。双着丝粒(dic)染色体分析是生物剂量估算的金标准[1]，但该方法非常耗时，并不适用于大规模核事故情况下的生物剂量估算。遗传工作站具有dic自动分析功能，但有假阳性和假阴性，无直接使用价值。我室通过舍弃假阴性，人工剔除假阳性，建立了国内第一条“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”[2]，可将遗传工作站原先无直接使用价值的双着丝粒自动分析功能有效利用，大幅度减少人工分析时间，每例生物剂量估算标本人工分析时间从原来的数小时缩短为数分钟。该方法填补了我国大规模核事故情况下早期、快速、高通量生物剂量估算的技术空白。为了使该方法利于在不同实验室间的推广，本文对不同实验条件下的影响因素进行了研究，该项研究国内鲜见报道。
1 材料和方法 1.1 标本采集与照射将多名健康志愿者肝素锂抗凝外周血在37℃水浴下进行60Co离体照射(二级标准剂量学实验室)，照射剂量率为0.39 Gy/min，照射后在37℃水浴中修复2 h，照射剂量2、3 Gy。
1.2 标本培养与制备采用0 h加秋水仙素法进行细胞培养[3]。淋巴细胞培养液(青岛莱佛生物工程研究所)含RPMI 1640、胎牛血清、PHA、双抗。秋水仙碱浓度为0.04 μg/ml。每瓶5 ml淋巴细胞培养液加0.5 ml肝素锂抗凝血，37℃恒温箱培养50 h[4]。使用CP-Ⅱ-64(上海乐辰生物科技有限公司)自动细胞收获仪制备细胞悬液，CP-AS-40自动制片机(上海乐辰生物科技有限公司)制片，CP-G-24自动制染片机(上海乐辰生物科技有限公司)Giemsa染色。
1.3 自动双着丝粒染色体分析使用Metafer 4 (V.3.11.6)染色体扫描分析系统(德国MetaSystems公司)进行自动中期分裂相寻找及高倍图像采集。对采集的高倍数字图像，使用DCScore软件(德国MetaSystems公司)进行双着丝粒染色体自动分析并人工确认，记录人工确认的双着丝粒染色体数及软件给出的分析细胞数。
1.4 剂量估算及统计分析使用CABAS 2.0软件及本室拟合的“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”Y=0.018 06D2+0.012 79D+0.000 489 1(其中，Y为软件自动分析并人工确认的每细胞“dic”数；D为吸收剂量，Gy。估算剂量范围0.5~5 Gy，吸收剂量率0.39 Gy/min。)进行生物剂量估算[2, 5]。使用SPSS软件进行χ2检验，检测不同实验方法对剂量估算结果的影响。
1.5 受照血液放置不同时间接种培养对剂量估算结果的影响将3 Gy组受照外周血分别在20℃室温放置0、50 h后进行接种培养、制片、双着丝粒染色体自动分析(人工确认)，并使用“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”估算剂量。
1.6 细胞悬液浓度对估算剂量的影响取2 Gy组混合细胞悬液稀释9倍后作为低浓度组，未稀释悬液为高浓度组进行滴片，每张玻片滴40 μl细胞悬液，两组玻片的细胞密度不同，每张玻片分析相同细胞数，分别进行双着丝粒染色体自动分析(人工确认)，并使用“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”估算剂量。
1.7 中期分裂相分散度对估算剂量的影响取2 Gy组混合细胞悬液，调整全自动滴片仪的参数使同一份细胞悬液获得不同分散度的中期分裂相标本，一组为过分散(扫描细胞中染色体条数小于46条的细胞数 > 20%)，另一组为欠分散(扫描细胞中染色体存在重叠的细胞数 > 20%)，分别进行双着丝粒染色体自动分析(人工确认)，并使用“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”估算剂量。
1.8 染色深浅对估算剂量的影响取2 Gy组混合细胞悬液，相同条件滴片，一组Giemsa染色80 s，另一组染色240 s，分别进行双着丝粒染色体自动分析(人工确认)，并使用“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”估算剂量。
1.9 扫描次数对剂量估算的影响取2 Gy组混合细胞悬液，相同条件滴片，每张玻片使用遗传工作站相同参数扫描5次(每次用擦镜纸除去镜油)，分别进行双着丝粒染色体自动分析(人工确认)，并使用“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”估算剂量。
1.10 扫描灵敏度对估算剂量的影响取2 Gy组混合细胞悬液，相同条件滴片5张，每张玻片遗传工作站全玻片扫描2次。第一次遗传工作站灵敏度参数设置为6，第二次遗传工作站灵敏度参数设置为12。分别进行双着丝粒染色体自动分析(人工确认)，并使用“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”估算剂量。
1.11 载玻片不同部位采集的中期分裂相对估算剂量的影响取2 Gy组混合细胞悬液，相同条件滴5张玻片，遗传工作站全玻片自动扫描拍摄中期分裂图像，将每张玻片的细胞图像，按拍摄顺序分为头、中、尾三部分，分别进行双着丝粒染色体自动分析(人工确认)，并使用“双着丝粒染色体自动分析剂量效应曲线”估算剂量。
2 结果 2.1 受照血液放置不同时间接种培养对剂量估算结果的影响0 h组平均估算剂量为2.95 Gy，偏差-1.7%，50 h组平均估算剂量为2.60 Gy，偏差-13.3%。对0 h、50 h两组估算剂量值进行卡方检验χ2=0.038，P=0.999 82，P > 0.05，两组间估算剂量值的差异无统计学意义。受照血液20℃室温放置0~50 h不会对剂量估算产生影响。见表 1。
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表 1 血液放置时间对自动剂量估算结果的影响 |
对高浓度、低浓度两组估算剂量值进行卡方检验χ2=0.021，P=0.999 95，P > 0.05，两组间估算剂量值的差异无统计学意义。滴片时细胞悬液浓度(玻片细胞密度)差异不会对剂量估算产生影响。见表 2。
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表 2 细胞悬液浓度对自动估算剂量值的影响 |
对过分散和欠分散两组估算剂量值进行卡方检验χ2=0.031，P=0.999 88，P > 0.05，两组估算剂量值的差异无统计学意义。这是由于遗传工作站在进行双着丝粒染色体自动分析时具有自动剔除染色体条数明显过少和染色体形态欠佳的细胞的功能，因此中期分裂相分散度不会对剂量估算产生影响。见表 3。
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表 3 滴片分散度对自动估算剂量值的影响 |
对染色80秒和240秒两组估算剂量值进行卡方检验χ2=0.028，P=0.986 1，P > 0.05，两组估算剂量值的差异无统计学意义。染色深浅不会对剂量估算产生影响。见表 4。
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表 4 染色深浅对估算剂量的影响 |
对各组间估算剂量值进行卡方检验χ2=0.075，P=0.999 99，P > 0.05，各组估算剂量值的差异无统计学意义。同一张玻片可以根据需要多次重复扫描不会对剂量估算产生影响。见表 5。
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表 5 扫描次数对剂量估算的影响 |
对灵敏度分别为6和12的两组间估算剂量值进行卡方检验χ2=0.018, P=0.999 96, P > 0.05，两组估算剂量值的差异无统计学意义。遗传工作站不同灵敏度参数设置不会对剂量估算产生影响。见表 6。
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表 6 扫描灵敏度设置对估算剂量值的影响 |
对头、中、尾采集图像剂量估算值进行卡方检验，χ2=0.088，P=0.999 99，P > 0.05，各组估算剂量值的差异无统计学意义。玻片不同区域采集拍摄的染色体中期图像不会对剂量估算产生影响。见表 7。
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表 7 采集玻片不同部位中期分裂相对估算剂量的影响 |
戴宏、Gruel、Vaurijoux等报道的自动dic分析法可以快速准确地进行生物剂量估算[2, 6-7]，Romm H等报道六个实验室联合实验成功的建立了半自动的双着丝粒分析的新方法，该方法可作为大规模辐射事故剂量估算的高通量筛选工具[8]。双着丝粒染色体自动分析生物剂量估算方法可能是目前较为接近理想的生物剂量计，值得推广。为了使该方法得到更好的应用，开展实验影响因素研究十分必要。
本研究结果表明，受照血液采集后室温(20℃)放置50 h，不会影响自动生物剂量估算的结果，因此允许事故发生后采集的血液标本48 h内送达实验室。
中期分裂相的过分散以及欠分散均可能影响dic的检出率，但我们的实验结果显示不同分散度的标本自动剂量估算结果没有显著性差异，原因可能是遗传工作站对中期分裂相的形态优劣具有自动判别能力，形态不符合要求的中期分裂相不会被列为分析对象。只要检测标本中有一定数量的符合要求的中期分裂相，就不会对剂量估算结果产生大的影响。
滴片时的细胞悬液浓度可影响染色体的分散以及遗传工作站每个视野的细胞数。我们的研究未发现细胞悬液浓度(细胞密度)对自动剂量估算结果带来影响，因此滴片时可以加大细胞悬液浓度，使每张玻片上分布较多的中期细胞，从而减少滴片工作量。我们的经验表明加大细胞悬液浓度后每例标本只需制备1张玻片，就可满足分析需要。
样本玻片染色过深可能影响检测结果，但我们的实验结果显示没有影响，可能是遗传工作站具有自动调节采集图像灰度及亮度的功能，可以将不同染色深浅的标本自动调节为最合适的深浅度，因此不会对剂量估算结果产生影响。
遗传工作站可以自动扫描搜索中期分裂相，提高软件灵敏度设置可以提高中期分裂相的检出率，但无效图像数也会增加。在中期分裂相较少的情况下提高灵敏度设置可减少漏检，增加的无效图像会在软件dic自动分析时自动过滤，不会对dic畸变率产生大的影响。
本实验显示，采集玻片不同区域的染色体中期图像，以及同一张玻片除去镜油后多次扫描，均不会影响图像采集及dic自动分析，不会对自动剂量估算值产生影响。因此可以对同一张玻片进行分区、多次扫描，根据需要逐步增加细胞数，达到缩短检测时间的目的。
本文通过对可能影响自动生物剂量估算结果的7种因素进行研究，发现受照血液采集后室温放置50h、滴片细胞悬液浓度、中期分裂相分散度、染色深浅、重复扫描、扫描灵敏度设置、玻片细胞采集部位均不影响自动生物剂量估算结果，各组间P > 0.05，差异无统计学意义。实验细节的一般性改变，不会对自动生物剂量估算结果带来影响，有利于该方法的推广普及。当然，实验过程中过于极端化的操作，还是可能对剂量估算结果带来影响，实验过程的标准化有利于保持检测结果的稳定和准确。
我们建立的染色体双着丝粒自动分析生物剂量估算方法经过对多种条件及因素的研究，明确了它们的影响情况，也证明了双着丝粒染色体自动分析生物剂量估算具有较好的重复性和很高的分析速度，适用于大规模辐射事故下快速高通量的生物剂量估算，可能具有较好的推广应用价值。
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