茶多酚(tea polyphenols, TP)是从绿茶中提取的多酚类物质，具有抗癌、抗衰老、抗辐射、降低血糖血脂、提高机体免疫力等多种天然生物活性，在食品加工、保健、医药等领域有重要应用^[1-3]。在当前现代通讯工具、荧屏等低剂量、长时间的电磁辐射无处不在的情况下，以天然活性成份作为辐射防护剂，进一步检评茶叶抗辐射的药理作用，利用我国丰富的自然资源和渊博的中医宝库为防治辐射所致的疾病提供新手段、新途径，其意义显而易见。本实验拟采用⁶⁰Co γ射线对中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)及整体动物进行照射，观察TP对γ射线损伤细胞染色体畸变及小鼠骨髓细胞微核形成的干预作用，研究TP的抗辐射机理，为辐射防护新药的开发和临床应用提供可靠的实验依据。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 茶多酚

浙江大学茶学系王岳飞教授惠赠。

1.1.2 细胞株

中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)购自上海细胞所。

1.1.3 实验动物

选择健康KM小白鼠80只，体质量20~24g，雌雄各半，购自第三军医大学实验动物中心。[实验动物生产许可证号：SCXK-(军)20120011，使用许可证号：SYXK-(军)2007035]。

1.1.4 主要试剂

1640培养液为Hyclone公司产品, 小牛血清为浙江天杭生物科技公司产品。秋水仙素及阳性诱变剂丝裂霉素C(Mitomycin-C, MMC)、环磷酰胺(cyclophosphamide, CP)均为Sigma公司产品, 其他为国产AR级试剂。

1.1.5 肝微粒体酶活化系统(S9)制备

采用苯巴比妥钠和β-奈黄酮联合诱导方法制备。操作过程需注意无菌和局部冷环境。

1.2 方法^[4] 1.2.1 哺乳动物细胞染色体畸变实验

选用CHL细胞。

1.2.1.1 半数抑制浓度(IC₅₀)确定

将培养的单层细胞经酶消化制成细胞悬液, 接种于培养瓶中, 细胞数为5×10⁶个/瓶，共5组，分别加入TP, 浓度为0、12.5、25、50、100 μg/ml, 4 h后换液继续培养。第2 d观察细胞生存情况，经试验确定半数抑制浓度为25 μg/ml。

1.2.1.2 辐照剂量确定

细胞分为7组, 用25 μg/ml TP接触4 h后换液, 继续培养3 h, 进行⁶⁰Co γ照射，其中阳性对照组只加阳性对照剂(- S9：MMC0.25 μg/ml，+ S9：CP20 μg/ml), 不照射。阴性对照组不加TP只加培养液。另5组辐射剂量分别为0.5、1.0、2.0、4.0 Gy。辐照后继续培养24 h, 收获细胞前4 h均加秋水仙素0.2 μg/ml, 胰酶消化, 制片。每组观察100个中期细胞, 记录出现的各类染色体畸变类型, 计算畸变率。判定标准为染色体畸变率 < 5%为阴性(-), >5%为可疑(±), >10%为阳性(+), >20%为阳性(++), >50%为阳性(+++)。辐照剂量大于1 Gy均引起细胞突变。

1.2.1.3 染色体畸变试验

实验在±S9条件下进行。将生长期细胞分为6组，分别为空白对照组、阳性对照组、模型对照组，另3组为TP保护组(分别加TP 12.5、25、50 μg/ml)，4 h后换液，继续培养3 h，除空白和阳性对照组外均给予2 Gy ⁶⁰Co γ照射, 照射后继续培养24 h，此后步骤同1.2.1.2。

1.2.2 小鼠骨髓微核实验 1.2.2.1 取材时间确定

小鼠自由摄食摄水, 按实验动物检疫要求检疫观察1周, 剔除不合格动物。经预实验确定⁶⁰Co照射剂量为6 Gy，故以6 Gy照射小鼠后分别于12、24、36、48、72 h取材、制片, 观察5 h的微核细胞率。

1.2.2.2 动物分组与给药

50只小鼠随机分为正常对照组(不照射，不给药)、模型组(照射后不给药)，TP保护组(高、中、低剂量分别于照射后给TP 725、145、29 mg/kg灌胃)，分别相当于1/2、1/10、1/50 LD₅₀^[5]。每组10只，正常对照组和模型组小鼠给予生理盐水灌胃，0.1 ml/10 g，TP保护组分别给予相应剂量TP，每日一次。

1.2.2.3

照射方式和剂量：给药14 d后除正常对照组外，其余各组小鼠置于专用辐照盒内制动以保证照射的均匀性，给予⁶⁰Co γ射线一次性照射，照射剂量6 Gy，照射时间9分23秒。在预实验5个时间点取材的基础上, 确定在照射24 h后处死小鼠, 见表 1。

1.2.2.4 制片

取两侧股骨骨髓, 涂片, 甲醇固定, Giemsa染色, 双盲法油镜下每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PCE)的微核细胞数, 计算微核率, 以‰表示。

1.2.3

辐射源：⁶⁰Co γ源, 由第三军医大学辐照中心提供。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0程序进行单因素方差分析，两两比较采用q检验。P < 0.05认为有统计学差异。

2 结果 2.1 CHL染色体畸变实验

2 Gy ⁶⁰Co γ辐射诱发了CHL染色体发生畸变，畸变率与空白对照组相比明显增加(P < 0.01)，畸变类型以双着丝粒染色体及环状染色体为主。在培养体系中加入不同浓度TP后，CHL染色体畸变率下降，尤以TP中、高剂量组(25、50 μg/ml)下降明显，肝微粒体酶活化系统对畸变率没有明显影响(见表 1、2)。结果表明，TP具有抑制⁶⁰Co γ辐射诱发CHL染色体畸变增加的效应，即似具有抗辐射诱变的作用。

2.2 微核实验

微核实验结果见表 3、4。由表 3可以看出, 小鼠受6 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后12 h，骨髓PCE的微核即显著增多，24 h达到高峰，随后在36~72 h一直保持在一个高平台水平，这是电离辐射致遗传物质染色体损伤的结果。由表 4可以看出，TP保护组小鼠PCE微核率均低于辐照模型组，说明TP具有抑制电离辐射诱发微核细胞增加的效应，具有抗辐射诱变的作用。其中高、中剂量组与模型组相比较，相差显著(P < 0.05)，但各剂量组间相差不显著。

3 讨论

辐射对生物体生殖细胞遗传物质的损伤，即诱发基因突变和染色体畸变，可能会在子一代(F1)中表达为各种先天性畸形，而且还会在以后的许多世代中出现，表现出遗传效应。CHL细胞是染色体畸变试验的首选细胞株，使用广泛，结果可靠。本文选用CHL细胞检测茶多酚对⁶⁰Co γ辐射诱发染色体畸变的影响，结果表明，2 Gy ⁶⁰Co γ辐射即诱发了CHL染色体畸变，畸变类型以双着丝粒染色体及环状染色体为主。而在培养体系中加入不同浓度TP后，CHL染色体畸变率下降，尤以TP中、高剂量组(25、50 μg/ml)下降明显，肝微粒体酶活化系统对畸变率没有明显影响。说明TP具有抑制⁶⁰Co γ辐射诱发CHL染色体畸变增加的效应，具有抗辐射诱变的作用。

微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺丝受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内而形成^[4]。微核试验观察技术简易省时，应用广泛。本次实验结果显示，小鼠受6 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后12 h，骨髓PCE的微核即显著增多，24 h达到高峰，随后在36~72 h一直保持在一个高平台水平，这是电离辐射致DNA断裂、遗传物质损伤的结果。而高、中剂量TP保护组小鼠PCE微核率均明显低于辐照模型组，说明TP具有抑制电离辐射诱发微核细胞增加的效应，具有抗辐射诱变的作用。

综合CHL染色体畸变实验和小鼠骨髓细胞微核实验结果说明TP能部分对抗⁶⁰Co γ辐射诱发的CHL细胞染色体畸变和微核形成，对染色体损伤有保护作用，具有抗辐射作用，其详细机制尚待深入研究。以茶多酚为主要成分开发天然药物和功能性食品具有广阔的应用前景。