正己烷(n-Hexane)又名己烷、二丙基、无水己烷等, 为无色挥发性液体, 是工业生产中常用的有机溶剂之一, 具有高挥发性和高脂溶性的特点, 可在体内蓄积且具有神经毒性^[1], 工作场所中如通风不良或防护不当, 能够引发职业性正己烷中毒^[2]。1957年意大利最先报道由正己烷导致的“制鞋匠的中毒性周围神经病”, 后日本、台湾相继有正己烷职业中毒事件报道。自上世纪80年代以来, 我国几乎每年都有群体性正己烷中毒事件发生, 尤其以沿海地区多见^[3-4]。正己烷慢性中毒可导致严重的周围神经病变, 但目前缺乏反应正己烷在体内对机体损害程度尤其是周围神经病变的有效生物标志物, 给正己烷慢性中毒的早期诊治带来很大困难, 动物试验表明正己烷可引起红细胞膜血影蛋白(Spectrin, Sp)交联, 且与正己烷中毒程度可能有关^[5-6]。本文以广东省某市某精密玻璃企业正己烷接触工人为研究对象, 以该厂办公室工人为对照, 分析红细胞中Sp蛋白含量与正己烷中毒所致神经系统症状以及神经电生理指标之间的相互关系, 探讨红细胞Sp作为正己烷周围神经病变以及正己烷慢性暴露生物标志物的可行性。

1 对象和方法 1.1 对象

广东省某市精密玻璃有限公司4例发生疑似职业性慢性正己烷中毒的工人, 同时选取该企业内不接触正己烷工作岗位的4位同性别、同年龄段的办公室工作人员作为对照组。

1.2 仪器和试剂

TWA-300Z低流量空气采样器(盐城天悦仪器仪表有限公司); GC-7890B气相色谱仪(美国Agilent公司); GCMS-QP2010 plus质谱仪(日本SHIMADZU公司), Multiskan Mk3酶标仪(美国Thermo公司); Amershan Imager 600凝胶成像系统(美国GE公司); Image J2×软件(德国Bawak Software公司); 丹麦KEYPONTV202型肌电诱发电位仪(丹麦Dantec公司); 兔多克隆Spectrin(alpha+beta)抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体(abcam公司), 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher公司); 吐温20-磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline with Tween-20, PBST)、超敏增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)检测试剂盒(中国碧云天生物技术公司); 辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase, HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(Immunoglobulin G, IgG))抗体(美国affinity公司)。

1.3 方法 1.3.1  

现场职业卫生调查采用现场职业卫生调查方法, 对工作场所的生产工艺流程、生产物料、工人防护情况等进行现场调查。依据GBZ/T 160《工作场所空气有毒物质测定方法》和GBZ2.1-2007《工作场所有害因素职业接限值第1部分:化学有害因素》的有关要求, 按照GBZ/T160.42-2007《工作场所空气有毒物质测定芳香烃类化合物》和GBZ/T160.38-2007 1《工作场所空气有毒物质测定烷烃类化合物》的要求, 采集包装车间擦拭岗位、成品抽检岗位、摄像头擦拭岗位和办公室(对照组区域)等工作场所空气, 气相色谱仪检测工作场所空气中苯、甲苯、正己烷、二甲苯、1, 2-二氯乙烷的浓度, 以每天工作13小时, 每周工作6天计算其时间加权平均浓度(Time-weighted average, TWA), 结果与该危害因素的时间加权平均容许浓度(permissible concentration-time weighted average, PC-TWA)比较。同时采集工作场所中使用的丙酮、抹机水、开油水、退镀液、脱膜粉、环保清洁剂、环保清洗液、环保抹机水共8个样品, 采用气相色谱-质谱联用仪检测其中主要挥发组分百分含量, 以﹤0.1%为未检出。

1.3.2 职业健康体检

参照GBZ 188-2014《职业健康监护技术规范》的相关要求, 对8名工人进行职业健康检查。

1.3.3 职业病诊断

依据GBZ 84-2002《职业性慢性正己烷中毒诊断标准》, 组织3名以上职业病诊断医师对4名疑似中毒工人进行集体诊断。

1.3.4  

蛋白免疫印迹法检测工人红细胞Sp蛋白表达水平采集8名工人外周静脉血, EDTA抗凝后2500 r离心5 min, 分离、裂解红细胞提取红细胞总蛋白, BCA试剂盒进行蛋白定量。配制体积分数为8%的分离胶和5%浓缩胶, 按照每孔蛋白上样80 μg, 上样体积30 μL, 恒压100 mV电泳20 min后, 在350 mA条件下湿式转膜70 min, 以质量分数为5%的脱脂奶粉37℃下封闭1 h, 4℃下Sp(1:1000稀释)抗体孵育过夜, PBST漂洗4次, 每次5 min; 将膜转入山羊抗兔IgG-HRP(1:30000稀释)中, 37℃反应1 h; PBST洗膜5次, 每次5 min; ECL显色, AI600凝胶成像系统显像, Image J2×软件定量分析。同时设定为GAPDH为参照蛋白, 以Sp蛋白与GAPDH的灰度值比来定量分析红细胞Sp蛋白的相对表达水平。

1.3.5  

神经-肌电图检查采用肌电诱发电位仪分别检查以下神经:(1)正中神经、尺神经、腓总神经的运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity, MCV)和运动神经传导远端潜伏期, (2)正中神经、尺神经和腓肠神经的感觉神经传导速度(sensory nerve condution velocity, SCV)、感觉神经动作电位波幅(sensory nerve action potential, SNAP), (3)拇短展肌、胫前肌安静状态下的自发电位、收缩时运动单位动作电位。测定方法及判断标准参照GBZ 76-2002《职业性急性化学物中毒性神经系统疾病诊断标准》及有关文献^[7-8]。

1.3.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析, 外周血红细胞及Sp蛋白相对表达采用独立样本t检验, 检验水准为α=0.05。

2 结果 2.1 研究对象基本情况

4位疑似正己烷中毒患者均在包装车间从事擦镜片工作, 分别从事擦拭岗位、成品抽检岗位、摄像头擦拭岗位, 工作中接触抹机水、丙酮等, 未采取任何防护措施, 车间为密闭式空调环境。在研究调查前6个月内, 每天工作时间13小时以上, 经常性加班至22点。其中有3位在调查研究前3个月陆续无明显诱因出现双手乏力感、并自腕关节以下麻木, 随后出现下肢麻木感, 自膝关节以下逐渐加重, 且睡醒后双侧腓肠肌疼痛, 后出现行走困难甚至无法站立, 1名感觉双腿和双手乏力、麻木。其余4位工人在办公室从事文职工作, 四肢均无不适感觉, 运动正常。

2.2 现场职业卫生调查

检测结果显示工人工作车间(包装车间擦拭岗位、成品抽检岗位、摄像头擦拭岗位)和办公室的现场空气的苯、甲苯、正己烷、二甲苯和1, 2-二氯乙烷的时间加权平均浓度均低于职业接触限值。采集车间中的8份物品中, 丙酮、开油水、退镀液和退膜粉中均未检到正己烷, 抹机水、环保清洁剂、环保清洗液和环保抹机水4个物品中挥发性有机组分在90.2%~99.2%之间, 正己烷含量在0.3%~13.9%之间, 以环保抹机水和抹机水中相对百分含量最高, 分别为13.9%和12.6%, 结果如表 1所示。

2.3 职业健康体检结果

自诉“有四肢麻木、乏力”的3名疑似正己烷中毒工人的四肢肌力出现不同程度的降低, 肌力3~4级, 肌张力减弱, 均出现跨伐步伐; 神经系统检查均有跟腱反射减弱, 其中2人浅感觉减弱, 1人出现肱二头肌、膝腱反射减弱。1名疑似正己烷中毒工人出现上下肢自觉感觉减退, 另外4人(办公室工人)在神经系统常规检查、肌力、肌张力检查方面均未见异常表现。8人在血常规、血生化、血沉、心电图、腹部B超、胸片和各系统常规检查均无异常表现。

2.4 神经-肌电图检查结果

对2.3出现肌力及神经系统异常的3名疑似正己烷中毒工人(病例1~3)进行神经-肌电图检查, 发现3位均呈现重度神经源性损害, 表现为运动神经MCV减慢, 运动神经传导远端潜伏期延长, 且病例1和病例3的腓总神经均未能导出; 感觉神经SCV减慢, SNAP下降; 拇短展肌、胫前肌无随意运动单位。鉴于正己烷中毒目前尚无特效治疗药物, 3位工人入院给予营养神经、促进神经修复、改善微循环、功能锻炼肌对症支持治疗, 并定期进行神经电生理检测。病例1经过630天治疗后呈现仍旧表现为重度神经源性损伤肌电图, 左侧腓总神经仍未能引出M波。病例2经过328天治疗后表现为轻度-中度神经性损害, 病例3经过630天治疗后呈现为轻度神经性损害。对其余5人进行神经肌电图检查, 均无异常发现。

2.5 职业病诊断结果

综合分析4名疑似正己烷中毒工人的职业史、职业病危害接触史、临床表现和辅助检查结果, 结合现场职业卫生调查信息, 依据GBZ 84-2002《职业性慢性正己烷中毒诊断标准》, 诊断结果为3名工人被诊断为职业性慢性正己烷重度中毒, 其余1名因未出现周围神经系统损害的临床表现, 不予以诊断为职业性慢性正己烷中毒。

2.6 红细胞Sp蛋白表达情况

经WB检测, 8名工人均出现清晰的Sp蛋白电泳条带, Sp蛋白表达比较结果见图 1和表 2。其中病例1、2和3是诊断为职业性慢性正己烷中毒的病患, 病例4为接触正己烷但非职业性慢性正己烷中毒的病患, 病例5~8为对照组即不接触正己烷的办公区域工作人员。经统计分析, 正己烷接触工人的Sp蛋白表达低于对照组(P < 0.05), 且病例1和2的Sp蛋白的表达明显降低(分别为0.65和0.45);另外病例1~4与病例5~8两组人群在外周血红细胞数量、血红蛋白、红细胞压积、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度方面, 差异无统计学意义(P>0.05)(表 2)。

3 讨论

含正己烷的溶剂和清洗剂广泛应用于触摸屏生产、光学、电子等新兴行业及钟表、五金、制鞋、印刷等传统行业, 职业性慢性正己烷中毒成为广东省的主要职业病之一。在本次调查中, 正己烷作为去污清洁剂使用于光学行业中, 接触的4名工人均为年轻女性, 从事的岗位时间均超过6个月, 每天工作时间13个小时以上, 每周工作6天; 使用的物料中含有一定比例的正己烷, 加之在密闭车间, 通风不良, 使得正己烷浓度增高, 且工人在工作中未佩戴手套、口罩等个人防护用品, 这是本次正己烷中毒事件发生的主要原因。但工作场所空气中正己烷的时间加权平均浓度低于职业接触限值, 提示为较低浓度长期接触正己烷。因此本次正己烷中毒具有隐匿性, 病变进展较为缓慢, 经过职业健康体检及职业病诊断, 同一车间4名工人有3名发生重度正己烷慢性中毒, 表现明显的周围神经病变症状。

多年来研究者一直在寻找可以有效反映正己烷神经系统损害的生物标志物。部分研究通过建立正己烷外周神经损伤动物模型来探讨血清中可能的生物标志物, 发现大鼠血清神经元特异性烯化酶对正己烷所致神经损伤的灵敏度最高, 神经丝蛋白次之^[9], 大鼠血清2, 5-己二酮与氨基残基形成的吡咯加合物可作为反映慢性正己烷中毒早期神经损伤的生物标记物等^[10]; 部分研究通过检测正己烷接触工人血清进行探索, 发现血清髓鞘P0蛋白可作为反映正己烷短期效应的生物标记物^[11]。本研究以职业卫生现场调查和职业健康检查结果为依据, 在排除其他有毒有害物质对人体的影响的前提下, 筛选正己烷接触人群(含正己烷中毒病人), 并按照性别、年龄配置了合适的工作人员作为对照组, 通过检测外周血Sp蛋白的含量, 来评价Sp蛋白作为反映正己烷神经损伤的生物标志物的可行性。

Sp蛋白最先发现于红细胞内, 由α亚基和β亚基组成一个较大的异源二聚体蛋白, 它与神经丝同属于细胞膜骨架蛋白, 在维持细胞膜的稳定性、结构及形状中其重要作用^[12]。随着对Sp蛋白结构和功能的深入研究, 发现其还参与多种生物途径如神经突触活动调节^[13], 其突变可导致多种人类疾病如遗传溶血性贫血、5型脊髓小脑共济失调、先天性神经病和中枢性耳聋^[14]。Valentine等^[15]通过动物试验研究发现二硫化碳可使红细胞Sp及神经细丝都形成蛋白质交联物, 交联作用与染毒时间和染毒剂量都存在累积剂量-效应关系, 且均出现在轴索肿胀发生前; 由于红细胞寿命较长, 交联结构稳定, 取材方便, 结构较简单, 故可用红细胞Sp交联物作为二硫化碳接触的生物标志物。黄建勋等^[5]研究中发现正己烷可能会引起SD大鼠外周血红细胞Sp共价交联, 且与正己烷中毒程度可能有关, Sp共价交联可作为正己烷周围神经毒性效应替代标志物。本文通过检测正己烷接触工人外周血Sp蛋白含量, 发现较对照组(办公室人员)相比, Sp含量减低, 差异有统计学意义(P < 0.05), 提示正己烷接触可以影响人外周血的Sp的含量; 并且正己烷接触工人组中中毒病例1和2外周血Sp蛋白表达明显降低, 虽经治疗(600天和328天后)但仍提示为重度或轻-中度神经系统损害, 进一步提示Sp的减低程度可能与正己烷对患者损伤的严重程度呈现一定的相关性。由于正己烷目前暂无理想替代品, 在相当一段时间内仍大量使用, 慢性正己烷中毒引起的周围神经损伤仍可能发生。因此一个明确的正己烷分子效应生物指标对了解正己烷慢性中毒引起的神经损伤的发生、预后、预防和及时治疗有着非常重要的意义。但是鉴于本次调查研究样本数量的局限, 如需进一步确定外周血Sp蛋白表达作为正己烷接触人群神经损伤的生物标志物的特异性、敏感性以及其与损伤的剂量效应关系, 尚需扩大调查对象的数量, 进一步深入验证。