造血系统是电离辐射主要靶器官之一, 敏感性高, 导致造血功能损害, 动物模型对于药物筛选以及疫苗的研制等均具有重要意义[1]。由于不同品系小鼠的遗传背景不同, 所以存在着较大的个体差异, 不同品系小鼠对药物效价测定的结果影响较大, 所以实验动物选择是否得当, 直接关系着实验的成功和质量的高低, 采用高质量、具有针对性的动物进行实验研究, 不但能排除动物本身对实验的影响, 而且也能节省时间, 获得准确、可靠、重复性好的实验数据[2]。本实验选用IRM-2、615、ICR、C57BL/6J四种遗传背景不同的小鼠, 进行γ射线照射, 测定各品系小鼠及照射后造血及免疫系统指标的变化, 为辐射损伤模型的研究及应用提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 动物IRM-2近交系小鼠由本所培育, 合格证号SCXK(津) 2005-0001; ICR小鼠、C57BL/6J小鼠由北京维通利华实验动物中心提供, 合格证号SCXK (京) 2002-0003; 615小鼠由血研所动物室提供, 四品系小鼠各20只, 雄性, 体重为21~22 g。
1.2 主要仪器与试剂血细胞计数仪(pocH-100i, 希森美康, 日本), RPMI1640, 10%胎牛血清(FBS), 青霉素, 链霉素, L-谷胺酰氨, 白细胞计数稀释液。137Cs γ射线照射源(加拿大原子能有限公司, USD, Autocell40, 剂量率0.85 Gy/min)。
1.3 分组及照射将IRM-2、615、ICR、C57BL/6J四种小鼠各分为对照组和照射组, 每组10只, 照射组进行137Cs γ射线4.0 Gy一次性全身照射。
1.4 外周血常规指标测定在照射后的第四周, 小鼠眼球取血200 μl, EDTA-K3抗凝, 用血细胞计数仪测外周血白细胞数:白细胞分类采用传统的显微镜分类法, 取血、推片、自然晾干, 瑞氏染色, 蒸馏水漂洗晾干后, 显微镜下按白细胞形态学特征计算中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。
1.5 脏器指数及骨髓有核细胞测定取小鼠一侧股骨, 用PBS冲出骨髓后, 用血细胞计数仪测定骨髓有核细胞数(BMNC); 取小鼠胸腺、脾脏称重, 用公式计算脏器指数, 脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠体质量(g)。
1.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的测定将PBS注入小鼠腹腔后收集腹腔后巨噬细胞, 1500 rpm/15 min离心, 弃上清, 加入1640培养基, 取100 μl混合液, 细胞浓度为1 × 106/ml。放在24孔板中, 孔内加入鸡红细胞吞噬4 h后染色, 计数。用公式计算吞噬率和吞噬指数, 吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/所计数的巨噬细胞总数× 100%, 吞噬指数= (200个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞)。
1.7 数据统计统计结果用x±s表示, 两组比较用t检验, P＜0.01为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同品系小鼠外周血及白细胞分类IRM-2、615、C57BL、ICR小鼠白细胞计数及分类结果见表 1。从结果可以看出, IRM-2小鼠白细胞总数明显高于其他三品系小鼠, 与615、C57BL/6J、ICR三品系小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01), ICR小鼠与615小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01), C57BL/6J小鼠与615小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01)。
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表 1 不同品系小鼠白细胞计数及分类结果 |
结果见表 2, IRM-2小鼠WBC、淋巴细胞比例均高于ICR、615、C57BL/6J小鼠, IRM-2小鼠WBC的数量与ICR、615、C57BL/6J小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01), 淋巴细胞比例均高于其他三品系小鼠, 与ICR、615小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01)。C57BL/6J小鼠淋巴细胞比例与615小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01)。
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表 2 137Cs γ射线4.0 Gy照射不同品系小鼠外周血结果 |
结果见表 3, IRM-2小鼠BMNC数高于ICR、615和C57BL/6J小鼠, 比较差异有统计学意义(P＜0.01、P＜0.01)。
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表 3 不同品系小鼠免疫及造血功能结果 |
结果见表 4, IRM-2小鼠BMNC数高于ICR、615和C57BL/6J小鼠, 比较差异有统计学意义(P＜0.01), 脾重指数高于615和C57BL/6J小鼠, 但差异没有统计学意义。C57BL/6J小鼠BMNC数高于ICR、615小鼠, 但差异没有统计学意义。
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表 4 137Cs γ射线4.0 Gy照射不同品系小鼠免疫及造血功能结果 |
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图 1 不同品系小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能比较 |
IRM-2小鼠的巨噬细胞吞噬率均高于其他三品系小鼠, 与615、ICR、C57BL/6J三品系小鼠比较差异有统计学意义(P＜0.01), 615小鼠与C57BL/6小鼠比较, 差异有统计学意义(P＜0.01)。ICR小鼠与C57BL/6J小鼠比较, 差异有统计学意义(P＜0.01)。
3 讨论实验动物是保证现代科学实验研究的一个必不可少的条件。其贯通于多科学, 诸如生物学、遗传学、生殖生理学、人类营养学、免疫学及疾病的预防、诊断和治疗中[3-4], 由于小鼠的基因与人类具有良好的同源性且其在生命科学和医药研究方面的应用颇为广泛[5-6], 白细胞对机体具有重要的保护作用, 是机体免疫系统的重要组成部分[8]。其中中性粒细胞和单核细胞都具有较强的吞噬功能。它们担负着吞噬细菌、病毒等功能, 机体受到辐照后, 骨髓细胞的增殖、分裂功能受到损伤, 导致血细胞来源减少, 从而引起外周血象不同程度的变化。但各类细胞寿命不同, 辐射敏感性不同, 其中淋巴细胞变化最为明显[7-8], 本研究结果显示, IRM-2小鼠白细胞总数明显高于ICR、615和C57BL小鼠。骨髓有核细胞数则是反映骨髓损伤的较敏感指标, 骨髓有核细胞的变化代表机体造血组织恢复的能力。小鼠骨髓有核细胞主要是提高造血功能[4-9]。本实验显示IRM-2小鼠骨髓有核细胞明显高于ICR、615和C57BL小鼠。同时IRM-2小鼠具有很强的吞噬功能, 提示IRM-2小鼠非特异性免疫功能可能较强。
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