现阶段, C形臂X射线机被广泛应用于骨科手术当中[1]。作为临时评估手术质量的影像工具, 术者在一次手术过程中常给予患者反复使用C形臂X射线机。来自C形臂X射线机的电离辐射(ionizing radiation)不仅对受照人群(患者和部分术者)产生不同程度的辐射损伤, 还能导致受照人群产生心理恐慌。研究显示C形臂X射线机(单次或者几次扫描)的辐射剂量处于低剂量电离辐射(low dose radiation, LDR)范围内, 所以研究C形臂X射线机诱导的生物效应不仅能进一步阐明LDR诱导的生物效应, 还能为临床手术合理使用C形臂X射线机提供有效的理论依据[2-3]。
1 材料和方法 1.1 试剂与仪器总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS快速法)、GSH检测试剂盒、活性氧检测试剂盒和融解RIPA裂解液均购自碧云天生物技术研究所。小鼠γ-H2AX购于北京中杉金桥生物技术有限公司生产。流式细胞仪(BD公司, 美国)由吉林大学基础实验中心提供。C形臂X射线机由吉林大学中日联谊医院提供。头部、体部剂量模体和热释光剂量计(thermolumine-cence dosimeter, TLD)由吉林大学卫生检测中心提供。
1.2 实验动物分组及照射条件昆明小鼠由吉林大学动物实验中心提供。SPF级, 雄性, 体重(20±0.9) g。随机为对照组、单次、二次、四次、八次、十六次组, 每组6只。C形臂X射线机全身扫描各组小鼠, 1 h和24 h后取样检测。管电流80 mAs, 管电压60 kV, 标准电功率5 kW, 扫描时间0.57 s, 用热释光剂量计测量各组小鼠的吸收剂量率, TLD芯片外科植入小鼠皮下、胸部和腹部, 测得每组的剂量率为16.72、35.12、133.76和267.53×10-5Gy·h-1。
1.3 细胞悬液制备小鼠眼球取血置于肝素抗凝的离心管中, 裂解液裂解红细胞, 磷酸盐缓冲液(1×PBS)洗两次, 计细胞数后备用。取小鼠的双侧股骨, 1号注射器冲出骨髓细胞, 过滤制成单细胞悬液, 计细胞数后备用。
1.4 组织匀浆的制备取小鼠脾脏组织后迅速放入液氮中速冻后, 贮存于-80℃冰箱备用。取已冻存的脾脏组织, 在冰面上把它剪切成细小的碎片, 加入组织裂解液, 用研磨杵充分研磨组织。10 000转离心15 min, 分装冻存每组上清, 备用。
1.5 T-AOC、GSH和ROS检测取各照射组小鼠的组织上清, 根据总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS快速法)、GSH检测试剂盒和活性氧检测试剂盒规定步骤, 依次检测各组小鼠的T-AOC、GSH和ROS水平。
1.6 γ-H2AX检测取已制备各组细胞悬液, PBS洗涤2次, 抗体比例稀释为1:200, 避光孵育30 min, 混匀后流式细胞仪检测。
1.7 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计分析, 对于定量资料, 先进行正态性分布检验, 如果服从正态分布, 数据以平均值±标准差(x±s)表示, 则采用t检验; 如不服从正态分布, 采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 C形臂X射线机扫描诱导脾脏中ROS、GSH和T-AOC变化(表 1)
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表 1 不同次数C形臂X射线机扫描诱导小鼠脾脏中ROS、GSH和T-AOC的变化(%, x±s) |
和对照组相比, 四次、八次和十六次扫描显著增加了脾脏中ROS的水平(P＜0.05), 八次、十六次扫描降低了GSH含量(P＜0.05), 十六次扫描极大的降低了T-AOC (P＜0.05), 差异具有统计学意义。
2.2 C形臂X射线机扫描诱导小鼠外周血淋巴和骨髓细胞的γ-H2AX水平(表 2)|
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表 2 CT扫描后1 h小鼠外周血淋巴、骨髓细胞γ-H2AX的变化(%, x±s) |
和对照组相比, 四次、八次和十六次扫描增加了小鼠外周血淋巴的γ-H2AX水平(P＜0.05), 八次和十六次扫描增加了骨髓细胞的γ-H2AX水平(P＜0.05), 差异具有统计学意义。
2.3 C形臂X射线机扫描诱导骨髓细胞周期进程变化(表 3)|
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表 3 不同次数C形臂X射线机扫描对小鼠骨髓细胞周期进程变化(%, x±s) |
和对照组相比, 十六次扫描增加了骨髓细胞G0/G1期和G2/M百分率(P＜0.05), 八次和十六次扫描降低S期百分率(P＜0.05)。
3 讨论目前, C形臂X射线机被广泛的应用于骨科手术当中。C形臂X射线机不仅能在术中及时有效的评估手术质量, 还能对患者的手术预后做出评估。然而, 临床术者频繁使用C形臂X射线机会导致患者体内辐射剂量的累积, 超过一定限度就会导致辐射损伤或者肿瘤发生。此外, 因为LDR诱导的生物效应存在巨大争议, 而单次或少量多次C形臂X射线机扫描的辐射剂量处于LDR范围内[3]。所以本实验研究结果不仅能进一步丰富LDR诱导的生物效应, 还能为临床术者科学使用C形臂X射线机直接的科学指导。
电离辐射诱导生物体产生大量的氧化应激(oxidative stress), ROS作为是活性氧的重要组成部分, 与糖尿病、肿瘤等和机体的生理、病理过程密切相关[4]。本实验发现四次、八次和十六次扫描显著增加了脾脏中ROS的水平, 八次、十六次扫描降低了GSH含量, 十六次扫描极大的降低了T-AOC的水平。结果表明短期内反复多次的C形臂X射线机扫描导致小鼠机体产生了大量氧自由基, 改变了氧化和抗氧化平衡稳态。而GSH和T-AOC的降低亦证实反复多次的C形臂X射线机扫描会对小鼠的氧化平衡产生显著影响。
电离辐射诱导DNA双链断裂(DSBs)形成磷酸化组蛋白γ-H2AX, 后者被认为是DSBs的早期标志物[5]。持续的DNA损伤能导致形成异倍体细胞和染色体突变, 威胁机体的基因组稳定性和诱发恶性肿瘤(乳腺癌和淋巴瘤)的发生。本实验发现四次、八次和十六次C形臂X射线机扫描增加了小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤(γ-H2AX)水平, 八次和十六次扫描增加了骨髓细胞的DNA损伤水平。本研究表明高频的C形臂X射线机扫描能导致生物体细胞(外周血淋巴和骨髓细胞)的DNA损伤, 机体若不能及时启动DNA损伤修复机制, 将直接影响基因组稳定性和诱发肿瘤。
电离辐射诱导的DNA损伤能进一步的激活细胞周期检查点(cell cycle checkpoint)。细胞周期阻滞(cell cycle arrest)是一种清除受损细胞和维持机体的基因组稳定性的保护性机制[6]。本实验发现十六次扫描增加了骨髓细胞G0/G1期和G2/M百分率, 八次和十六次扫描降低S期百分率(P＜0.05)。结果表明骨髓细胞在受到高频C形臂X射线机扫描后, 及时启动了细胞周期阻滞, 清除了具有潜在突变的细胞维护机体的"稳态平衡"。
本研究表明高频C形臂X射线机扫描影响了小鼠的氧化平衡, 诱导了活体细胞的DNA损伤和细胞周期阻滞, 提示C形臂X射线机扫描对小鼠产生了不同的辐射损伤效应。
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