丙戊酸钠(valproic acid，VPA)是抗癫痫的常用药物，研究证实作为选择性组蛋白脱乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)它能通过诱导多种肿瘤细胞的凋亡[1, 2]和增加其辐射敏感性[3, 4]，起到辅助杀伤肿瘤的作用。VPA单用或者合用其他药物能显著增加肝癌细胞的化疗作用[5, 6]，但是VPA在肝癌放疗中的增敏作用仍缺乏研究，本实验以VPA作为人肝癌SMMC-7221细胞的放疗增敏剂，观察其放疗增敏作用，并深入探讨了其可能的作用机制，为临床肝癌放疗增敏提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞培养及传代人肝癌SMMC-7221细胞株由吉林大学基础医学院实验室提供，RPMI 1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清、AnnexinV/PI试剂盒购自南京凯基生物公司，丙戊酸钠(VPA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养和VPA处理人肝癌SMMC-7221细胞株采用10%胎牛血清DMEM培养液置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。VPA处理:空白对照组、VPA处理组(浓度分别为0.75、1.5、3.0、6.0、8.0 mmol/L)和VPA +照射组(照射剂量分别为0、1、2、4、6、8 Gy)。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖细胞接种于96孔培养板，每组设6个复孔。VPA干预24 h、48 h和72 h后，每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT溶液10 μL，再继续培养4 h，弃上清后每孔加150 μLDMSO，避光轻微震荡5 min使结晶充分溶解，酶联免疫检测仪测定吸光度A值，检测波长570 nm，以不加细胞培养液孔调零，根据A值计算细胞增殖情况。
1.2.3 照射条件国产XSZ-220/20固定式X射线深部治疗机，电压180 kV，电流18 mA，滤板0.25 Cu; 单次靶皮距60 cm，吸收剂量率0.364 Gy/min。
1.2.4 克隆形成实验制备人肝癌SMMC-7221单细胞悬液，计数活细胞后，调整细胞密度，接种于6孔板后进行不同照射剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)照射，照射后置37℃、5% CO2培养箱培养。继续培养10 ~ 14 d，结晶紫染色后，进行细胞集落计数。克隆形成率(PE) =克隆数/接种细胞数× 100%;细胞存活分数(SF) =实验组克隆形成率/对照组克隆形成率。用Graphpad Prism 5.0软件拟合细胞存活曲线，计算平均致死量(D0)、准域剂量(Dq)、2 Gy照射后细胞存活分数(SF2)、外推数(N)以及放射增敏比(SER)。这些数值与SMMC-7221细胞的放射抗性成正相关。
1.2.5 流式细胞术检测细胞周期和凋亡细胞接种于6孔培养板，每组设3个复孔，VPA干预24 h、48 h和72 h后，收集各组细胞，预冷PBS洗涤细胞2次，调整细胞浓度为1 × 106，每孔加入预冷乙醇固定，4 ℃过夜，加入浓度100 mg/L的RNase 10 μL，浓度50 mg/L的碘化丙啶缓冲液300 μL，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪(FACSCalibur，美国Becton Dickinson公司)检测细胞周期。
1.3 统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计分析，对于定量资料，先进行正态性分布检验，如果服从正态分布，数据以x ± s表示，则采用t检验; 如不服从正态分布，采用秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 VPA对SMMC-7221细胞增殖影响(表 1)
|
表 1 不同浓度VPA对SMMC-7221细胞增殖的抑制作用(x± s) |
MTT实验显示在经过VPA处理24、48、72 h后，SMMC-7221细胞的增殖受到明显抑制，具有时间依赖性(P < 0.05);而在同一时间点内，随着VPA浓度的增加，SMMC-7221细胞的增殖也明显受到抑制(P < 0.05)。VPA作用SMMC-7221细胞24、48、72 h的IC50分别为41.26、9.04、2.87 mmol/L。
2.2 VPA对SMMC-7221细胞的放射增敏作用单纯照射组(IR)的SF2、D0、Dq分别为71.20、2.34、1.96; VPA + IR组的SF2、D0、Dq则分别为55.49、1.68、1.47。VPA + IR组的SER为1.46。如图 1所示，VPA + IR组较IR组的肩区变窄缩小，提示细胞亚致死性损伤修复能力显著降低，各剂量点SMMC-7221细胞的存活分数均明显低于IR组。
|
图 1 克隆形成曲线 |
|
|
表 2 IR组、VPA组和VPA + IR组对SMMC-7221细胞凋亡的影响 |
|
图 2 对照组、IR组、VPA组和VPA + IR组对SMMC-7221细胞凋亡影响流式图 |
和对照组相比，IR组、VPA组和VPA + IR组SMMC-7221细胞凋亡率均显著升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)。VPA + IR组凋亡率亦明显高于IR组和VPA组(P < 0.05)。
2.4 VPA对SMMC-7221细胞周期的影响(表 3)|
|
表 3 IR组、VPA组和VPA + IR组对SMMC-7221细胞周期分布的影响 |
和对照组相比，IR组、VPA组和VPA + IR组均不同程度增加了SMMC-7221细胞G0/G1期细胞比例，降低了S期细胞比例，对G2/M期没有显著影响。
3 讨论放射治疗在肝癌的治疗中发挥着有限的作用，由于正常肝脏组织对IR具有较高的辐射敏感性，放疗极易发生辐射诱导肝病(Radiation Induced Liver Disease，RILD)[7, 8]。Hennequin等[9]研究表明和一些来自上皮的肿瘤相比，肝癌组织对电离辐射具有较高的辐射抗性，α/β比值大约为15 Gy[9]。肝癌细胞的放射敏感性还与癌细胞的组织学来源、细胞的分化程度和癌组织的周围环境有关。肝癌细胞的辐射抗性和RILD限制了放射剂量的提高，放疗增敏剂的恰当使用变得尤为重要。研究证实组蛋白低乙酰化和HDACs高表达与肿瘤发生、进展密切相关[10, 11]，在已有的报道中，VPA作为HDACIs能起到化疗和放疗增敏的作用[12, 13]，但VPA联合放疗对肝癌细胞的杀伤作用还未有明确报道。
本研究从VPA + IR对人肝癌SMMC-7221细胞增殖抑制、细胞凋亡增加和周期阻滞来探讨VPA的放疗增敏机制。结果显示VPA能有效的抑制SMMC-7221细胞的增殖及克隆形成能力，而且具有时间和放射剂量的依赖性。凋亡作为I型程序性细胞死亡，在肿瘤进展和抑制中发挥着重要作用。本实验研究证实和对照组相比，IR组、VPA组和VPA + IR组SMMC-7221细胞凋亡率均显著升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)。VPA + IR组凋亡率亦明显高于IR组和VPA组。提示VPA能致敏SMMC-7221细胞对电离辐射敏感性，显著增强了放疗敏感性。细胞周期结果显示VPA联合放疗不同程度增加了SMMC-7221细胞G0/G1期细胞比例，降低了S期细胞比例，对G2/M期没有显著影响。
总之，在人肝癌SMMC-7221细胞常规放疗过程中，VPA可以作为有效的放疗增敏剂，起到增加杀伤肿瘤细胞的作用。其机制与增加SMMC-7221细胞的凋亡水平、诱导G0/G1期细胞阻滞有关。VPA的放疗增敏作用也为肝癌细胞的治疗提供了新的策略。
| [1] |
Han BR, You BR, Park WH. Valproic acid inhibits the growth of HeLa cervical cancer cells via caspase-dependent apoptosis[J]. Oncol Rep, 2013, 30(6): 2999-3005. DOI:10.3892/or.2013.2747 |
| [2] |
Shirsath N, Rathos M, Chaudhari U, et al. Potentiation of anticancer effect of valproic acid, an antiepileptic agent with histone deacetylase inhibitory activity, by the cyclin-dependent kinase inhibitor P276-00 in human non-small-cell lung cancer cell lines[J]. Lung Cancer, 2013, 29(4): 365-366. |
| [3] |
Shoji M, Ninomiya I, Makino I. Valproic acid, a histone deacetylase inhibitor, enhances radiosensitivity in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2012, 40(6): 1412-1416. |
| [4] |
Van Nifterik KA, Van den Berg J, Slotman BJ. Valproic acid sensitizes human glioma cells for temozolomide and γ-radiation[J]. J Neurooncol, 2012, 107(1): 61-67. DOI:10.1007/s11060-011-0725-z |
| [5] |
Li X, Zhu Y, He H, Lou L. Synergistically killing activity of aspirin and histone deacetylase inhibitor valproic acid (VPA) on hepatocellular cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 436(2): 259-264. DOI:10.1016/j.bbrc.2013.05.088 |
| [6] |
Tatebe H, Shimizu M, Shirakami Y. Acyclic retinoid synergises with valproic acid to inhibit growth in human hepatocellular carci-noma cells[J]. Cancer Lett, 2009, 285(2): 210-217. DOI:10.1016/j.canlet.2009.05.019 |
| [7] |
Ursino S, Greco C, Cartei F. Radiotherapy and hepatocellular carcinoma: update and review of the literature[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(11): 1599-1604. |
| [8] |
Liang SX, Huang XB, Zhu XD. Dosimetric predictor identification for radiation-induced liver disease after hypofractionated conformal radiotherapy for primary liver carcinoma patients with Child-Pugh Grade A cirrhosis[J]. Radiother Oncol, 2011, 98(2): 265-269. DOI:10.1016/j.radonc.2010.10.014 |
| [9] |
Hennequin C, Quero L, Rivera S. Radiosensitivity of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Radiother, 2011, 15(1): 39-42. DOI:10.1016/j.canrad.2010.11.004 |
| [10] |
Tang J, Yan H, Zhuang S. Histone deacetylases as targets for treat ment of multiple diseases[J]. Clin Sci (Lond), 2013, 124(11): 651-662. DOI:10.1042/CS20120504 |
| [11] |
Groselj B, Sharma NL, Hamdy FC. Histone deacetylase inhibitors as radiosensitisers: effects on DNA damage signalling and repair[J]. Br J Cancer, 2013, 108(4): 748-754. DOI:10.1038/bjc.2013.21 |
| [12] |
Koutsounas I, Giaginis C, Patsouris E, et al. Current evidence for histone deacetylase inhibitors in pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(6): 813-828. DOI:10.3748/wjg.v19.i6.813 |
| [13] |
Sharma NL, Groselj B, Hamdy FC, et al. The emerging role of histone deacetylase (HDAC) inhibitors in urological cancers[J]. BJU Int, 2013, 111(4): 537-542. DOI:10.1111/bju.2013.111.issue-4 |