金丝桃素是贯叶连翘提取物。前期的研究表明, 金丝桃素对坏死组织有特异性亲和, 是一种很好的靶向药物载体^[1]。对其进行放射性核素标记, 可获得以坏死组织为靶点的靶向放疗药物。金丝桃素为苯并二蒽酮类化合物, 其化学构架上含多个适合进行碘的亲电取代反应的点位(见结构式)。本文报告了以Iodogen为氧化剂, 对金丝桃素进行的碘-131亲电取代标记的方法研究及结果。

1 材料与方法 1.1 试剂及仪器

金丝桃素(纯度大于98%) (由成都普瑞发科技开发有限公司提供), 碘-131水溶液(由北京原子高科股份有限公司提供), Iodogen(1, 3, 4, 6tetrachloro-3α, 6α-diphenylglycouril) (SIGMA出品), 二氯甲烷(天津市科密欧化学试剂有限公司), DMSO(天津市巴斯夫化工有限公司), NaHCO₃ (淄博化学试剂厂), Na₂CO₃(淄博化学试剂厂), Hcl(淄博化学试剂厂), 新华1号滤纸(杭州新华造纸厂), 放免测定仪SN-695B(上海日环仪器厂), 核素扫描仪NSC -350(科大创新股份有限公司中佳分公司)。活度计Rm905-a(中国计量院)。

1.2 实验方法 1.2.1 Iodogen涂管制备

配制5 mg/mL Iodogen二氯甲烷溶液, 移取10 μL该溶液置于1 mL具塞试管中, 用真空泵抽干二氯甲烷, 即得50μg Iodogen涂管。密闭冷藏保存。

1.2.2 标记率测定

以新华1号滤纸为固定相, 以0.1N Hcl为展开剂, 对反应液进行纸层析分析。展开后, 标记物位于原点, 游离碘位于前沿。核素扫描仪扫描显示, 层析条中间部分无放射性拖尾存在。标记率测定时将层析条居中剪开, 分别测定计数。标记率=原点计数/(原点计数+前沿计数)。

1.2.3 金丝桃素浓度及标记反应时间对标记率的影响

在50 μg Iodogen涂管加入不同浓度的金丝桃素-DMSO溶液100 μL, 再加入20 μL碘-131水溶液7.4 × 10⁷Bq/mL(2 mCi/mL), 反应10 min测定各管标记率, 以确定金丝桃素溶液浓度对标记率的影响。

1.2.4 反应体系中水份比例对标记率的影响

取5只50 μg Iodogen涂管, 每只先加入100 μL金丝桃素二甲基亚砜溶液(1 mg/mL), 再以蒸馏水和二甲基亚砜调整管内溶液的水份比例, 总体积保持在150 μL, 最后加入3.7 × 10⁵Bq(10μCi)碘-131水溶液, 反应10 min后测定标记率, 以确定水份比例对标记率的影响。

1.2.5 pH值对标记率的影响

以碘-131水溶液及碳酸盐溶液配制pH值分别为7、9及11的碘-131水溶液7.4 × 10⁷Bq/mL(2 mCi/mL)。在3只50 μg Iodogen涂管中加入100 μL金丝桃素-DMSO溶液(1 mg/mL), 再分别加入不同pH值的碘-131水溶液20 μL, 10 min后测量标记率, 以测定所用碘-131溶液的pH值对标记率的影响。

1.2.6 Iodogen量对标记率的影响

配制1 mg/mL的Iodogen/DMSO溶液, 1 mg/mL的金丝桃素/DMSO溶液及7.4 × 10⁷Bq/ml (2 mCi/mL)的碘-131水溶液, 以不同量的Iodogen进行金丝桃素的碘-131标记, 测定Iodogen用量对标记率的影响。

1.2.7 标记物的脱碘率测定

将100 μL金丝桃素- DMSO溶液(1 mg/mL)移入Iodogen涂管(50 μg Iodogen)中, 再加入20 μL碘-131水溶液3.7 × 10⁹Bq/mL (100 mCi/mL), 反应10 min。标记完成后, 标记物于标记管中避光室温保存。每天以纸层析法测定游离碘-131的比例。检测至第7天。

1.2.8 Iodogen在二甲基亚砜中的活性衰减

配制5 mg/mL Iodogen二甲基亚砜溶液, 并在配制后的不同时间用其对金丝桃素进行碘-131标记。标记管中依次加入100 μL金丝桃素/DMSO溶液、10 μL碘-131溶液1.85 × 10⁶Bq (50 μCi)及10 μL Iodogen溶液, 10 min测量标记率。

2 结果

Iodogen涂管通常作为固态氧化剂用于放射性碘的氧化标记^[2]。但本实验中制备涂管仅仅是为了方便使用, 因为在标记过程中Iodogen是溶解在DMSO中的, 并非以涂层形式参与标记反应。

TLC法是测量标记率的常用方法。我们采用的新华1号滤纸-盐酸体系, 简单而有效。我们也曾试用过硅胶G-乙醇-乙酸乙酯体系^[3], 未重复出文献中的结果。

金丝桃素属于苯并二蒽酮类化合物, 其结构含多个适合进行碘的亲电取代反应的点位。有人曾以过氧乙酸为氧化剂进行金丝桃素的放射性碘标记, 结果并不理想^[4]。我们以Iodogen为氧化剂进行的标记, 取得了良好的标记效果。

表 1的结果表明, 使用适当的标记条件(金丝桃素溶液浓度≈1 mg/mL, pH值为7, 50 μg Iodogen)进行碘-131标记, 标记反应在几分钟内即可完成, 标记率可达98%以上。由于标记过程中金丝桃素和Iodogen都是过量的(相对于碘-131), 标记物的比活度可通过加入的碘-131量来控制。

我们在标记过程中可通过加入碘-131的量来获得所需比活度的标记物, 但加入碘-131水溶液时应控制体积, 以免水的比例过大导致金丝桃素析出。

表 2的结果显示, 在均相条件下, 标记率不受水份比例的影响, 但我们在实验中发现, 水份比例过高时, 金丝桃素会随时间延长而析出。

由于市售碘-131水溶液有些呈碱性(国外提供的实验用碘-131水溶液多为碱性), 我们研究了碱性环境对标记率的影响。结果显示, 与pH值7、9、11相对应的标记率为98%、36%及20%。pH值越高, 标记率越低。若标记时发现碘-131溶液为碱性(反应液变蓝), 则使用pH值为7的缓冲液将反应液pH值调回到7, 再加Iodogen, 仍可获得满意的标记率。

Iodogen用量与标记率呈正相关(见表 3), 用量不足则难以获得满意的标记率。在这种情况下可通过添加Iodogen来完成标记。

金丝桃素与碘-131的结合比较稳定, 室温下避光保存, 一周内未发现碘的脱标现象。

使用Iodogen涂管进行标记时, Iodogen是溶于DMSO的。Iodogen溶于DMSO后, 随着时间的增加, 其氧化活性降低, 影响标记效果(见表 4)。所以若标记过程中使用Iodogen溶液, 则必须是新鲜配制的。

3 小结

以Iodogen为氧化剂的金丝桃素碘标记流程, 操作简单, 标记率高。制得的标记物稳定性好。高达99%的标记率使得标记物可直接使用而无需纯化, 这对于放射性标记物制备来说尤为重要。

考虑到金丝桃素有三个标记点位, 所以标记物其实是一碘、二碘和三碘金丝桃素的混合物。若想获得特定的标记物, 还需使用HPLC分离。

在不经纯化而直接使用的情况下, 标记液内会有Iodogen存在。先前动物实验结果提示残留的Iodogen和溶剂不会构成毒性隐患^[5]。

该标记流程已在几项研究中得到应用^{[6, 7]}。