研究发现肿瘤与时间节律的关系密切, 针对各种肿瘤患者的时辰节律而实施不同的最佳的治疗方案是近年来肿瘤治疗研究的热点。由于癌细胞的增殖周期有明显的时间特征, 而且与正常细胞的增殖周期有显著的差异, 选择最佳时间放疗即时辰放疗旨在最大程度杀伤肿瘤细胞的同时保护正常组织, 即放疗疗效最高, 副作用最小。本实验用流式细胞仪分析离体的人鼻咽癌细胞周期的变化, 并进一步绘制细胞存活曲线, 测定时辰照射的细胞存活率的差异, 以期为临床制定鼻咽癌时辰放疗方案提供实验依据。
1 材料 1.1 实验对象人鼻咽低分化鳞状上皮癌细胞系CNE-2。
1.2 试剂RPMI 1640培养液、小牛血清、PBS液、胰蛋白酶消化液、Giemsa染液、PI染液。
1.3 器材二氧化碳培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪、细胞培养板、细胞培养瓶、微量加样器。
2 方法及观察指标 2.1 细胞培养将CNE-2细胞系培养于含有新生小牛血清, 青霉素、链霉素各100 U/mL及碳酸氢钠调节pH值至7.2~7.4的RPMI 1640培养液中, 置于37℃恒温5% CO2培养箱中培养, 收集对数生长期细胞进行实验。
2.2 流式细胞仪检测细胞周期将处于对数生长期的细胞在一天内4个时间点(4 AM、10 AM、4 PM、10 PM)分别收集, 离心沉淀于PBS清洗, 加70%冰乙醇混匀, 4℃固定。经流式细胞仪检测前按标本准备流程处理细胞, 上机检测分析细胞周期, 收集数据, 在MultiCycle分析软件进行细胞周期分析, 计算G1、S、G2/M期的相对比例。
2.3 照射方法根据细胞周期绘制的曲线, 一天内在G2/M期细胞曲线的高峰和低谷2个时间点室温下单次照射细胞, 用60Co照射, 源距离细胞生长面70 cm, 射野大小10 cm×10 cm, 照射剂量率108~ 111 cGy/min, 剂量点取2、4、6、8 Gy共4点。
2.4 微量细胞克隆形成法根据照射剂量不同以不同细胞密度接种于96孔细胞培养板中, 贴壁后照射, 复置恒温条件下培养5 d养液, 在倒置显微镜下观察并记录细胞克隆数量。克隆标准为≥ 8个细胞组成的集落。细胞存活率SF(%)=计数所得克隆数/(接种细胞数×(空白克隆数/空白接种细胞数))×100%。
2.5 平板克隆形成实验根据照射剂量不同以不同细胞密度接种于6孔细胞培养板中, 贴壁后照射, 复置恒温条件下培养14 d弃培养液, PBS清洗, 10%甲醛固定, Giemsa染液染色, 空气干燥, 肉眼计数含有≥ 50个细胞组成的集落。细胞存活率计算同前。
全部实验中, 各个方法均设6个平行样本并重复3批实验。
2.6 实验数据分析采用SPSS软件one-way ANOVA各个周期细胞在4个时间点差异的显著性。采用independent-sample t test (独立样本t检验)对微量细胞克隆形成法和平板克隆形成实验观察不同时间点照射的细胞存活率SF进行分析, 检验分别在G2/M期细胞曲线高峰和低谷照射的SF的差异。P＜0.05差异有统计学意义。
3 结果 3.1 各细胞周期单因素方差分析结果(表 1)
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表 1 不同时间点各细胞周期的相对比例 |
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表 2 G2/M期细胞不同照射剂量10AM组与4PM组的细胞存活率(x±s, %) |
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表 3 G2/M期细胞不同照射剂量10AM组与4PM组的细胞存活率(x±s, %) |
在大多数生物中都可以找到生物节律, 现已证明在哺乳动物中超过300种生命活动呈现昼夜节律变化[1, 2]。已从细胞中克隆出与生物节律有关的生物钟基因, 基因相互作用以调节细胞的昼夜活动, 细胞周期的昼夜波动又调节其他基因的转录和转录后程序, 从而形成细胞24 h周期变化[3]。关于鼻咽癌细胞DNA合成的时间节律变化仅见孙健等[4]报道过, 其研究证实, 荷人鼻咽癌裸鼠的鼻咽癌细胞的DNA合成也有明显的昼夜节律变化。机体通过生物钟基因的表达, 使生理活动在24 h内呈现规律性变化, 峰值和谷值在预定时间发生, 完成正常组织细胞的生长、增殖代谢[5]。本实验以单因素方差分析表明离体鼻咽癌细胞的细胞周期随昼夜节律变化, 在一天24 h内4 AM、10 AM、4 PM、10 PM 4个时间点细胞周期的差异有统计学意义。
肿瘤组织的昼夜时间节律表现在:①它在宿主体内的生长有时间节律; ②癌细胞的增生和凋亡受生物钟基因调控; ③同一种抗癌药物, 仅某些时间给药是有效的[6]。目前针对肿瘤放疗的时间治疗研究开展尚少, 基础研究已经证实, 细胞对射线的敏感性因细胞自身周期而有差异, 当干细胞集团是同步的情况下, 在昼夜节律的不同时相以放射线照射, 动物致死量因放射时间不同而异[7]。放射线对肿瘤细胞的杀伤主要作用于G2/M期[8], 根据细胞周期曲线中的G2/M期的高峰10 AM和低谷4 PM来照射细胞, 通过微量细胞克隆形成法和平板克隆形成实验[9, 10]均可得出, 在高峰时照射的细胞存活率SF小于低谷照射时, 有统计学意义, 提示选择适当的时间给予肿瘤组织照射, 针对肿瘤细胞敏感期, 则望达到提高治疗比的效果, 即时辰放疗的意义所在, 根据一天的时辰节律来照射细胞的疗效优越性。本基础实验结果为鼻咽癌时辰放疗的时间选择提供了参考。
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