辐射能引起机体分子水平的复杂调控。电离辐射可诱导一系列具有重要功能的基因的表达增强或表达抑制。基因芯片技术具有快速、高效和高通量的特点, 使其在辐射分子生物学领域得到广泛关注和应用。基因芯片技术与实时荧光定量PCR技术相结合可对多个基因表达的改变进行分析。许多研究报道中采用基因芯片技术与实时荧光定量PCR技术相结合研究辐射诱导的相关基因[1-3]。
本实验室前期研究了人外周血淋巴细胞不同受照剂量及照后不同时间点差异基因表达谱的变化[4-6]。本研究以离体和全身照后大鼠外周血淋巴细胞为实验材料, 利用基因芯片技术对照后12 h的外周血淋巴细胞进行辐射差异基因筛选, 并对涉及到的基因通路进行分析, 以期为辐射损伤机制的研究提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料SD大鼠购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心, 生产许可证号: SCXK (军) 2007-004; Trizol购自Invitrogen公司; Agilent表达谱基因芯片由上海欧易生物医学科技有限公司提供。
1.2 外周血淋巴细胞的分离与培养所有大鼠均通过腹主动脉采血, 用等体积的D-hank’ s液在无菌条件下混匀新鲜采取的肝素抗凝血液, 沿离心管壁加到等体积的淋巴细胞分离液后离心, 吸取中间层淋巴细胞, 加入等体积D-hank’ s液离心, 重复洗涤一次, 得到所需的淋巴细胞, 加入含20%小牛血清的DMEM高糖培养基, 置于37 ℃, 5% CO2培养箱培养。
1.3 照射由中国辐射防护研究院附属医院提供60 Co γ射线照射, 照射剂量为2 Gy, 照射剂量率为117.1 cGy/min, 外周血淋巴细胞照后12 h提取细胞总RNA。
1.4 细胞总RNA的提取淋巴细胞总RNA的提取, 按照Invitrogen公司的Trizol试剂的操作说明书进行。
1.5 基因芯片结果的验证采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术对基因Srpk3、Tlr3和Enc1进行验证。用Roche LightCycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行实时PCR扩增, 以β-actin为内参基因, 引物序列及扩增条件见表 1。采用2-△△Ct法, 计算3条基因表达量的比值, 其值大于1表示相对于对照样本, 该基因表达上调; 反之则表达下调。
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表 1 RT-PCR验证芯片结果的引物序列及扩增条件 |
用基因芯片检测比较2 Gy 60Co γ射线照后12 h离体照射组淋巴细胞与未经照射的对照组淋巴细胞的基因差异表达情况, 筛选出差异3倍以上的基因2 001条, 其中表达上调的有1 258条, 表达下调的有743条(表 2)。利用KEGG数据库, 将差异基因进行Pathway富集分析, 得到22个KEGG通路。
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表 2 Gy γ射线照后12 h离体照射组与全身照射组差异基因结果 |
用基因芯片检测比较2 Gy 60Co γ射线照后12 h全身照射组淋巴细胞与未经照射的对照组淋巴细胞的基因差异表达情况, 筛选出差异3倍以上的基因2 590条, 其中表达上调的有1 621条, 表达下调的有969条(表 2)。利用KEGG数据库, 将差异基因进行Pathway富集分析, 得到35个KEGG通路。
2.3 离体照射组与全身照射组基因芯片结果比较离体照射组与全身照射组共同差异3倍以上的基因有312条。只在离体照射组表达差异3倍以上的基因有1 689条, 只在全身照射组表达差异3倍以上的基因有2 278条。离体照射组与全身照射组有10个共同的KEGG通路。只在离体照射组中发现的KEGG通路有12个, 只在全身照射组中发现的KEGG通路有25个。
2.4 基因芯片的验证结果结果显示, Srpk3、Tlr3和Enc1 3条基因的溶解曲线均为单一峰, 表明PCR扩增特异性较好。采用2-△△Ct法, 对3条基因的表达量进行分析, 发现3条基因的RT-PCR结果与基因芯片检测结果的差异表达趋势是一致的(表 3)。
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表 3 RT-PCR扩增的相对定量结果 |
本研究采用基因芯片技术研究2 Gy γ射线离体和全身照后12 h诱导的SD大鼠外周血淋巴细胞基因表达的改变。
离体照射组与全身照射组共同的KEGG通路有10个。这些通路涉及到谷胱甘肽代谢、细胞黏着分子、造血细胞系等生物学途径。离体照射组与全身照射组共同差异3倍以上的基因有312条, 涉及到KEGG通路的各个生物学途径。
myc基因是一类"快速早期反应基因"的细胞内信使, 在细胞由G0期进入G1期前就可因为有丝分裂原刺激而出现高表达, myc蛋白对促进细胞进入S期完成DNA合成具有关键作用[7]。本实验中myc在离体照射组与全身照射组中都表达下调。外胚层神经皮质基因1(Enc1, ectodermal-neural cortex 1) [8], 又称脑细胞核限制性蛋白或诱导p53基因10, 是一种肌动蛋白结合蛋白。Enc1高水平表达于神经系统, 参与人神经系统细胞分化过程和细胞恶性转化。本实验中Enc1在离体照射组与全身照射组中都表达上调。BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1) [9]可与BRCA1环指区形成稳定的异二聚体, 参与DNA损伤修复、转录调控和细胞周期调控; BARD1独立于BRCA1, 参与了诱导细胞凋亡。本实验中BARD1在离体照射组与全身照射组中都表达上调。UTS2在哺乳动物中有多样的生物学活性, 能影响心血管、肾脏、中枢神经系统和内分泌功能, 与平滑肌的功能、脂和糖的代谢有关。本实验中UTS2在离体照射组与全身照射组中都表达上调。
在离体照射组中单独发现的通路有12个。这些通路涉及到RNA聚合酶、细胞因子与细胞因子受体相互作用、胞吞作用、抗原加工和呈递等。本实验中离体照射组分离大鼠外周血淋巴细胞直接进行照射, 照后12 h的基因芯片结果显示, 离体照射组中大量的炎性和抗炎性细胞因子差异表达, 表明外周血淋巴细胞出现了炎症反应。
在全身照射组中单独发现的通路有25个。这些通路涉及到过氧化物酶体、黏着连接和B细胞受体信号途径等途径。黏着连接对维持组织结构和细胞极性非常重要, 能够控制细胞运动与增殖。B细胞受体信号途径: B细胞是适应性免疫中的一种重要成分, 它们能产生和分泌无数种不同的抗体分子, 每一种抗体分子能识别一个不同的抗原。这个信号途径将最后导致快速早期反应基因的表达, 这些基因的表达激活另一些参与B细胞增分化、免疫球蛋白产生和其他过程的基因表达。本实验中的全身照射组是大鼠经全身照射后提取淋巴细胞, 这些生物学通路的差异表达, 表明照射对大鼠的整体生理生化功能产生了影响。
本研究以离体和全身照后大鼠外周血淋巴细胞为实验材料, 研究了2 Gy γ射线照后12 h基因表达谱的变化, 筛选出大量差异表达基因, 这些基因涉及细胞凋亡、细胞周期及信号转导等多个生物学途径。这些结果将为进一步辐射差异基因的筛选及深入研究辐射相关基因在淋巴细胞辐射损伤中的作用提供依据。
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