中国辐射卫生  2012, Vol. 21 Issue (3): 257-258  DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.03.023

引用本文 

钱甜甜, 何颖, 王庆蓉, 陈伟, 沈先荣. 硼卡钠对辐射损伤细胞增殖能力的影响[J]. 中国辐射卫生, 2012, 21(3): 257-258. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.03.023.
QIAN Tian-tian, HE Ying, WANG Qing-rong, CHEN Wei, SHEN Xian-rong. Effects of BSH on the Proliferation of Cells Irradiated by γ-Ray[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2012, 21(3): 257-258. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.03.023.

基金项目

全军计划科研项目(08-3301), 海军医学研究所青年科研基金(08HY21)

通讯作者

沈先荣(1965~), 男, 研究员, 博士, 博士生导师, 主要从事海洋生物及中药研究。E-mail:xianrong_sh@yahoo.com

文章历史

收稿日期:2011-10-20
硼卡钠对辐射损伤细胞增殖能力的影响
钱甜甜 , 何颖 , 王庆蓉 , 陈伟 , 沈先荣     
海军医学研究所, 上海 200433
摘要目的 研究硼卡钠(sodium borocaptate, BSH)对Hela和HIEC细胞辐射后增殖能力的影响。方法137Cs γ射线对BSH作用下的Hela和HIEC细胞进行不同剂量的一次性照射(1Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy, 8Gy), 剂量率为0.8Gy/min。分别采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测和细胞克隆形成法检测细胞增殖情况。结果 MTT实验表明0.0036mg/ml~0.1150mg/ml BSH对3Gy照射后细胞具有明显的辐射保护作用(P < ;0.05);克隆形成实验发现BSH终浓度为0.060mg/ml时, 对不同剂量的辐射损伤具有不同程度的保护作用。结论 一定浓度的BSH对照后Hela细胞和HIEC细胞具有明显的促进增殖作用。
关键词硼卡钠    电离辐射    细胞增殖    MTT法    克隆形成法    
Effects of BSH on the Proliferation of Cells Irradiated by γ-Ray
QIAN Tian-tian , HE Ying , WANG Qing-rong , CHEN Wei , SHEN Xian-rong     
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433 China
Abstract: Objective To study the protective effect of BSH on the proliferation of Hela and HIEC cells irradiated by γ-ray. Methods Hela and HIEC cells which were given BSH, were exposed to 137Cs γ-ray one time with the different doses (1, 2, 3, 4, 6, 8 Gy) at the dose rate of 0.8 Gy/min. The proliferation of cells were measured by MTT assay and cell clone formation assay. Results MTT assay showed that BSH has a significant protective effect on cells at the concentration of 0.0036 mg/ml to 0.1150 mg/ml. Clone formation assay showed that the protective effect of BSH (0.060mg/ml) was different when cells exposed to different doses. Conclusion BSH can increase proliferation of Hela and HIEC cells irradiated by γ-ray.
Key words: Sodium Borocaptate    Radiation    Cell Proliferation    MTT Assay    Clone Formation Assay    

辐照后细胞增殖能力的强弱反映了辐射防护剂对细胞的保护作用。1967年, Soloway等合成了BSH。在欧洲和日本, BSH主要用于脑肿瘤硼中子俘获治疗, 近期也逐渐开始应用于头颈部肿瘤和肝癌的治疗[1-5]。研究表明BSH对低线性能量转换辐射具有保护作用[6], 且临床应用显示BSH对正常组织毒性极小[7, 8]。笔者采用MTT法和克隆形成法分别检测了BSH对照后细胞增殖能力的影响, 发现一定浓度的BSH对辐照后细胞的增殖具有显著促进作用。

1 材料与方法 1.1 细胞株

人宫颈癌细胞株(Hela)购自中国科学研究院细胞库, 人小肠绒毛上皮细胞株(HIEC)由第二军医大学防原教研室惠赠。

1.2 照射条件

Gamma cell 40, 137Cs γ射线(复旦大学放射医学研究所), 3Gy一次性照射, 剂量率为0.8Gy /min。

1.3 主要试剂与仪器

硼卡钠(BSH)购自捷克斯洛伐克Katchem有限公司; RPMI1640培养基购自美国Invitrogen公司; 小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)购自上海博光生物科技有限公司; 二甲亚砜(DMSO)购自上海博光生物科技有限公司; 酶联仪(Thermo ELECTRON CORPORATION); 凝胶成像系统(BIO - RAD Laboratories); CO2孵箱(Thermo ELECTRON CORPORATION)。

1.4 方法 1.4.1 细胞培养

使用含10%小牛血清的RPMI1640培养基(含100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素), 将两细胞株于37℃, 5% CO2孵箱中培养, 2 ~ 3d传代一次, 取对数增长期细胞进行实验。

1.4.2 BSH对细胞增殖能力影响的MTT法测定

收集对数生长期细胞, 用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配制成单细胞悬液(细胞浓度为1 × 104个/ml), 接种于96孔细胞培养板中, 每孔200μl。37℃, 5% CO2孵箱中培养18h。用无血清培养基配制不同浓度的BSH溶液, 0.22μm滤膜除菌后每孔加入20μl, 使终浓度分别为1. 15, 0.575, 0.288, 0.144, 0.072, 0.036和0.018, 对照组加入等体积无血清培养基, 每个浓度设3个平行样本。继续培养72h, 弃去培养基, 每孔加入MTT (0.4 mg/ml) 200μl, 孵育4 h后去上清, 加入DMSO 200μl, 室温振荡10min至结晶完全溶解, 于酶联仪上波长570nm处测定各孔光吸收值(OD值)。

1.4.3 BSH对3Gy γ射线照射细胞增殖能力影响的MTT法测定

配制BSH溶液使终浓度分别为0.115mg/ml, 0.0575mg/ ml, 0.0288mg/ml, 0.0144mg/ml, 0.0072mg/ml, 0.0036mg/ml, 继续培养24h后137Cs γ射线一次性照射, 照射剂量为3Gy。其他条件同上。

1.4.4 0.060mg/ml BSH对不同剂量γ射线照射细胞增殖能力影响的细胞克隆形成法测定

收集对数生长期细胞, 用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配制单细胞悬液(细胞浓度为500个/ml), 接种于6孔板中, 每孔2ml。37℃, 5% CO2孵箱中培养18h, 无血清培养基配制BSH溶液后0.22μm滤膜过滤, 给药组加入100μl使BSH终浓度为0.060mg/ml, 对照组加入等体积无血清培养基。继续培养24h, 137Cs γ射线一次性照射, 照射剂量分别为1,2,4, 6和8Gy。继续培养5d, 弃去培养基, 1 × PBS清洗2遍, 甲醇固定20min, l0% Gimesa染液染色20min, 蒸馏水冲洗后晾干, 凝胶成像系统计数。

1.5 统计分析

采用SPSS 14.0软件对结果进行t检验统计学处理。

2 结果 2.1 BSH对细胞增殖能力的影响

BSH对未照射细胞增殖能力的影响如表 1所示。BSH浓度在0.018mg/ml ~ 1.15mg/ml时, HIEC细胞增殖能力随浓度增加而下降, 呈一定的剂量依赖关系; BSH浓度在0.144mg/ml ~ 1.15mg/ml时, Hela细胞增殖能力随也与浓度呈剂量依赖关系; 在BSH浓度由0.288mg/ml到0.575mg/ml时, Hela、HIEC细胞增殖能力剧烈下降, 当浓度大于0.575mg/ml时, BSH对Hela、HIEC细胞的生长均有非常显著抑制作用(P < 0.01)。提示BSH在较高浓度时对Hela、HIEC细胞有毒性作用。

表 1 BSH对细胞增殖能力的影响
2.2 BSH对3Gy γ射线照射细胞增殖能力的影响

考察较低浓度BSH在3Gy γ射线照射Hela、HIEC细胞时对细胞增殖能力的影响, 结果如表 2所示。3Gy γ射线照射时, 0.0036mg/ml BSH对Hela、HIEC细胞均表现出显著的辐射保护效果(P < 0.05); 0.0072mg/ml BSH对Hela细胞有显著的辐射保护效果(与对照组比较, P < 0.05), 而对HIEC细胞则有非常显著的辐射保护效果(与对照组比较, P < 0.01);当BSH浓度为0.0144 mg/ml ~ 0.1150mg/ml时, BSH对Hela、HIEC细胞均表现出非常显著的辐射保护效果(P < 0.01)。提示较低浓度BSH对3Gy γ射线照射后细胞有显著的促进增殖作用。

表 2 BSH对3Gy γ射线照射细胞增殖能力的影响
2.3 0.060mg/ml BSH对不同剂量γ射线照射细胞增殖能力的影响

结果如图 1所示, HIEC、Hela细胞克隆数均随着辐射剂量的增大而减少。对于Hela细胞, 与空白组比较, 当照射剂量为1 Gy、2 Gy时, BSH组细胞集落数非常显著增多(P < 0.01), 当照射剂量为4、6、8 Gy时, BSH组细胞集落数显著增多(P < 0.05);对于HIEC细胞, 与空白组比较, 当照射剂量为1、2、4 Gy时, BSH组细胞集落数非常显著增多(P < 0.01), 当照射剂量为6 Gy、8 Gy时, BSH组细胞集落数仅有上升趋势, 无统计学意义(P > 0.05)。提示一定浓度的BSH对不同照射剂量照射后HIEC、Hela细胞均有促进增殖作用, 照射剂量越低, 作用越显著。

图 1 0.060 mg/ml BSH对不同剂量γ射线照射细胞增殖能力的影响 A: Hela细胞, B: HIEC细胞; * :与对照组比较, P < 0.05; **:与对照组比较, ** P < 0.01。
3 讨论

笔者通过MTT实验检测了BSH对细胞增殖能力的影响。在未照射情况下, BSH浓度大于0.575mg/ml时, 对肿瘤细胞(Hela)和正常细胞(HIEC)的生长均具有显著的抑制作用。因此, 选择较低浓度BSH (0.0036mg/ml ~ 0.1150mg/ml)对辐照后细胞的增殖能力进行检测。

BSH浓度为0.0144mg/ml ~ 0.1150mg/ml时, 3Gy γ射线照射后HIEC、Hela细胞增殖能力均非常显著高于对照组。而浓度更低时, BSH对细胞增殖能力的保护作用逐渐减弱。说明仅一定浓度的BSH对照射后细胞增殖能力有非常好的保护作用, 提示BSH的浓度优化是发挥其辐射保护作用的关键。

利用克隆形成法检测60μg /ml BSH作用下1 ~ 8Gy γ射线照射后两细胞株的增殖能力。结果证明, BSH对Hela细胞受到不同剂量辐射损伤均具有显著保护作用, 对HIEC细胞仅在较低剂量辐射损伤时具有显著保护作用, 提示一定浓度的BSH对不同细胞株的辐射保护作用存在差异。文献报道BSH主要在肿瘤组织中聚集[9], 我们推测这可能是BSH对肿瘤细胞和正常细胞辐射保护作用存在差异的主要原因, 但本实验仅对2株细胞株进行了实验, 其结果是否具有普遍性还有待进一步研究证明。

参考文献
[1]
Barth RF, Soloway AH, Goodman JH, et al. Boron neutron capture therapy of brain tumors:an emerging therapeutic modality[J]. Neurosurgery, 1999, 44(3): 433-450. DOI:10.1097/00006123-199903000-00001
[2]
Takagaki M, Oda Y, Miyatake S, et al. Boron neutron capture therapy:preliminary study of BNCT with sodium borocaptate (Na2 B12 H11 SH) on glioblastoma[J]. J Neurooncol, 1997, 35(2): 177-185. DOI:10.1023/A:1005766828165
[3]
Kageji T, Nagahiro S, Matsuzaki K, et al. Boron neutron capture therapy using mixed epithermal and thermal neutron beams in patients with malignant glioma-correlation between radiation dose and radiation injury and clinical outcome[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 65(5): 1446-1455. DOI:10.1016/j.ijrobp.2006.03.016
[4]
Wu G, Barth RF, Yang W, et al. Boron containing macromolecules and nanovehicles as delivery agents for neutron capture therapy[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2006, 6(2): 167-184. DOI:10.2174/187152006776119153
[5]
Suzuki M, Masunaga S, Kinashi Y, et al. Intra-arterial administration of sodium borocaptate (BSH)/lipiodol emulsion delivers B-10 to liver tumors highly selectively for boron neutron capture therapy:experimental studies in the rat liver model[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 59(1): 260-266. DOI:10.1016/j.ijrobp.2003.12.018
[6]
Yoshida F, Matsumura A, Yamamoto T, et al. Enhancement of sodium borocaptate (BSH) uptake by tumor cells induced by glutathione depletion and its radiobiological effect[J]. Cancer Lett, 2004, 215(1): 61-67. DOI:10.1016/j.canlet.2004.06.023
[7]
Barth RF. A critical assessment of boron neutron capture therapy:an overview[J]. J Neurooncol, 2003, 62(1-2): 1-5. DOI:10.1007/BF02699929
[8]
Barth RF, Coderre JA, Vicente MG, et al. Boron neutron capture therapy of cancer:current status and future prospects[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(11): 3987-4002. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-05-0035
[9]
Otersen B, Haritz D, Grochulla F. Binding and distribution of Na2B12H11SH on cellular and subcellular level in tumor tissue of glioma patients in boron neutron capture therapy[J]. J of Neurooncol, 1997, 33: 131-139. DOI:10.1023/A:1005789802603
表 1 BSH对细胞增殖能力的影响
表 2 BSH对3Gy γ射线照射细胞增殖能力的影响
图 1 0.060 mg/ml BSH对不同剂量γ射线照射细胞增殖能力的影响 A: Hela细胞, B: HIEC细胞; * :与对照组比较, P < 0.05; **:与对照组比较, ** P < 0.01。
硼卡钠对辐射损伤细胞增殖能力的影响
钱甜甜 , 何颖 , 王庆蓉 , 陈伟 , 沈先荣