电离辐射作用于机体的过程, 主要是大量的自由基如H^·、H ₂、H₂O₂、H_aq^-、OH^·、e_aq^-等作用于DNA、蛋白质、膜脂质分子等靶分子, 造成机体损伤, 其中在细胞DNA损伤过程中, OH^·发挥主要作用。电离辐射作用的"靶"主要是基因组DNA和生物膜, 而DNA、核膜、细胞器膜均在细胞核内。所以, 理想的自由基清除剂应当能够进入到细胞内、特别是细胞核内, 在电离辐射的瞬间立即清除自由基, 从而真正保护机体免受自由基的攻击。

1985年美国的Smally, Curl和英国的Kroto首次发现富勒烯(fullerene, C₆₀), 是由60个碳原子组成的具有特殊中空笼状结构的球形分子, 包括12个五元环、20个六元环和30个双键, 直径为0.71nm^[1]。由于富勒烯是一种非极性分子, 难溶于水, 仅能溶于非极性的有机溶剂如苯、甲苯、环己烷中, 而富勒烯的水溶性多羟基衍生物-富勒醇是良好的自由基清除剂, 它不仅能够清除OH^·、e_aq^-r等自由基, 而且可以清除体内的NO自由基^[2]。富勒醇清除自由基的机理可能与其具有的烯丙位羟基和电子亲和力有关。体外化学实验表明, 多种水溶性的富勒烯衍生物能清除自由基, 尤其是与OH^·和e_aq^-的反应速率常数可达(0.5~3.3)×10¹⁰M^-1S^-1[3]。水溶性富勒醇能够快速地穿过细胞膜, 到达细胞内, 并且主要分布于胞浆以及线粒体等细胞器中, 但我们前期实验表明, 水溶性富勒醇不能快速穿透细胞核膜分布于细胞核内, 因此无法直接保护DNA免受OH^·等自由基的攻击。如果能通过一种机制将其快速导入到细胞核内, 则具有重要的应用价值。

笔者以胺催化合成法合成C₆₀(OH)₂₄^[4], 并且通过使用生物材料, 将C₆₀(OH)₂₄包裹起来, 制备成新的纳米材料^{[5, 6]}, 在其表面连接与核受体具有高度亲和力的雌激素类似物, 使它能够通过多种生物屏障和核膜, 将富勒醇定向载带到细胞核内, 发挥其强大的自由基清除功能, 直接保护DNA靶分子免受自由基的攻击, 为研发真正理想的辐射防护药物提供理论与实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

HERA CO₂培养箱(德国Kedro公司), 恒温磁力搅拌器(DF-Ⅱ, 金坛市医疗仪器厂), F6/10超速匀浆机(上海FLUKO流体机械制造有限公司), 纳米粒度仪(NANOPHOX), 高分辨透射电镜(TecnaiG220, 美国FEI公司), 扫描电镜(HITACHI S-4700), 磁共振谱仪(美国瓦里安UNITY IVOVA-1000), 红外线谱仪(美国瓦里安FTS-1000), 高压微射流设备(MASSACHUSETTS, USA)超高效液相色谱串联质谱(waters ACQUITY Quattro Premier XE), TCP-SP型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。

富勒烯(99.9%标准品, 河南濮阳永新科技有限公司), 硬脂酸(AR, 中国菱湖精细化工厂·浙江), 胆固醇(AR, 沪试), 卵磷脂(AR, 沪试), 玉米油(Sigma, 德国), 吐温-80(E.M.K进口分装), 无水乙醇(AR, 沪试), 1640培养基(维森特公司), 胎牛血清(维森特公司), TBAH(AR, 沪试), 苯(AR, 沪试), H ₂O₂(AR, 沪试), 甲醇(AR, 沪试), 罗丹明-6G(AR, 沪试)。

仓鼠肺成纤维细胞Ⅴ79(购于上海细胞库), 用RPMI- 1640培养基(含10%灭活胎牛血清及双抗, 工作浓度为:青霉素100U/ml, 链霉素0.1mg/ml)培养, 培养箱CO₂浓度5%, 温度37℃, 2~3d传代一次, 复苏3代后用于实验。

1.2 方法 1.2.1 水溶性富勒醇的制备与表征 1.2.1.1 制备

称取100mgC₆₀溶于50mL的苯中搅拌过夜, 加入2mL2mol/L的NaOH溶液, 在磁力搅拌下加5滴40% TBAH溶液, 滴加0.5mL30%的H₂O₂溶液, 待苯液变无色, 水相变棕色即告反应结束。用分液漏斗分离有机相与水相, 并用2~3ml水将分液漏斗洗涤2次, 合并水相即富勒醇溶液。加甲醇20~30ml使其沉淀, 离心, 重复此操作3~4次, pH试纸测pH < 8即可。置于冷冻干燥箱内获得富勒醇粉末。

1.2.1.2 表征

① 红外光谱:取少量富勒醇粉末与干燥KBr一起研磨, 混合均匀, 压制成薄片, 将此薄片放入红外光谱仪, 扫描其红外吸收光谱。②氢核磁谱:以氘代DMSO为溶剂, 于核磁共振波谱仪测定富勒醇的氢核磁谱。③质谱:以甲醇水为流动相, 负离子模式下进行质谱分析。

1.2.2 细胞核靶向富勒醇硬脂质纳米粒的合成与表征 1.2.2.1 合成

称取100mg富勒醇粉末, 1000mg硬脂酸, 250mg胆固醇, 500mg卵磷脂, 1mg己烯雌酚, 600mg玉米油, 加入到2mL无水乙醇中充分溶解, 用超速匀浆机高速剪切5min, 12000bpm, 使其充分溶解并混匀, 旋转蒸发去除乙醇, 将其缓慢滴加至同温度的吐温-80水溶液, 加完后继续搅拌1h, 快速冷却到室温, 即得C₆₀(OH)₂₄-NLC-E初乳。将C₆₀(OH)₂₄- NLC-E初乳进行高压乳匀, 冷却后得到所需产品。

1.2.2.2 表征

① 纳米粒径分析:将C₆₀(OH)₂₄-NLC-E原液以去离子水稀释20倍, 置激光纳米粒度仪进行粒径分析。②透射电镜:将C₆₀(OH)₂₄-NLC-E原液稀释500倍, 滴于铜网上, 待充分干燥后进行透射电镜扫描, 电压2.0kV。③激光共聚焦显微镜:将Ⅴ79细胞接种于玻底培养皿中, 待细胞贴壁后加包裹罗丹明-6G的C₆₀(OH)₂₄-SLN-E, 充分混匀, 置激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果与讨论 2.1 富勒醇 2.1.1 红外光谱

以KBr压片, 利用红外谱仪测试所制备的富勒醇的红外吸收谱见图 1, 图中3433cm^-1处可见强而宽的羟基吸收峰, 说明该产物所含的羟基数目较多, 1578cm^-1处吸收峰为富勒醇中的C=C键伸缩振动峰, 1417cm^-1处为C-O键的伸缩振动吸收峰, 1089cm^-1处为C-O键的弯曲振动吸收峰, 进一步说明羟基存在。620cm^-1处可见指纹峰, 表明富勒烯发生加成反应, 与文献报道基本一致^[7-10], 这表明合成产物中含有大量羟基, 即C₆₀(OH)_x。

2.1.2 氢核磁谱

使用氘代DMSO为溶剂对制备的富勒醇进行核磁共振分析, ¹H-NMR图谱如图 2所示, δ=3.34处为氘代DMSO中含有杂质水所产生的水峰, δ=2.50处为DMSO溶剂吸收峰, δ=1.24处为OH特征峰, 进一步证明合成产物为C ₆₀(OH)_x^[11]。为了确定富勒烯所连接羟基个数, 对此合成产物进行了质谱分析。

2.1.3 质谱

富勒醇的质谱谱图为图 3, 图中m /z =719处峰代表C₆₀笼形结构^[11], 在719~1127范围内的峰, 平均间隔为68, 恰好为4个羟基的分子量, 说明部分富勒醇的结构在质谱分析中被打碎所致, m/z < 719为C₆₀的笼形结构被破坏所形成的碎片峰, 在m/z=1127处为C₆₀(OH)_x的准分子离子峰(M -1峰), 可见合成产物分子量为1128, 其所连接羟基数目为24, 即C₆₀(OH)₂₄。

2.1.4 扫描电镜

扫描电镜观察富勒醇水溶液, 可见富勒醇形态较为均一, 大小约为50nm, 有部分聚集体, 大小约为200~ 300nm, 见图 4。

2.2 细胞核靶向富勒醇硬脂质纳米粒(SLN) 2.2.1 纳米粒径分析

用激光粒度分析仪对C₆₀(OH)₂₄- SLN-E水溶液进行粒径分析, 可见50%的纳米粒子平均粒径为372nm, 90%的纳米粒子平均粒径为435nm, C₆₀(OH)₂₄- SLN-E纳米粒子粒径较为稳定、均一, 见图 5。

2.2.2 透射电镜

透射电镜下观察到C₆₀(OH)₂₄-NLC-E纳米粒的形态近似球形, 大小较为均一, 直径大约在300nm左右, 与激光纳米粒度仪测量结果相符, 见图 6。

2.2.3 扫描电镜

扫描电镜观察C₆₀(OH)₂₄-NLC-E水溶液, 可见纳米粒子形态近似球形, 包含有大量的C₆₀(OH)₂₄, 而且其所包含的C₆₀(OH)₂₄在纳米粒子中分布均一、密集, 见图 7。

2.2.4 激光共聚焦显微镜

制备包裹罗丹明-6G的C₆₀ (OH)₂₄-NLC-E, 制备产物于PBS中透析5~7d, 将游离罗丹明-6G完全透析出, 然后将Ⅴ79细胞培养传3代, 胰酶消化制成单细胞悬液, 接种于玻底培养皿中, 密度约为4×10⁴个/ml, 待细胞贴壁后, 细胞换液, 加入包裹罗丹明-6G的C₆₀(OH)₂₄ -NLC-E溶液, 与培养基混匀, 置激光共聚焦显微镜下观察, 5min后可见C₆₀(OH)₂₄-NLC-E快速进入细胞, 细胞核内有明显聚集, 表明包裹己烯雌酚的纳米粒能够将富勒醇载带到细胞, 并穿过核膜, 到达细胞核内, 充分发挥作用, 见图 8。

3 结论

本文以胺催化合成法制备富勒醇, 对所制备的产物进行红外扫描和核磁氢谱分析, 结果表明合成产物中含有大量的羟基, 即为C₆₀(OH)x, 再进一步通过质谱分析, 可知合成产物分子量为1128, 其所连接羟基数目为24, 即C₆₀(OH)₂₄。电镜下观察, 可见C₆₀(OH)₂₄形态较为均一, 大小约为50nm, 有部分聚集体。使用生物材料, 将C₆₀(OH)₂₄包裹, 其表面连接与核受体具有高度亲和力的雌激素类似物, 制备成C₆₀(OH)₂₄-NLC -E, 对该硬脂质纳米粒进行纳米粒径分析及电镜观察, 可见C ₆₀(OH)₂₄-NLC-E纳米粒的形态近似球形, 大小较为均一, 直径大约在300nm左右。制备包裹罗丹明-6G的C₆₀(OH)₂₄ -NLC-E, 于激光共聚焦显微镜下观察纳米粒子进入细胞的情况, 可见C₆₀(OH)₂₄-NLC-E快速进入细胞, 细胞核内有明显聚集, 表明包裹己烯雌酚的纳米粒能够将富勒醇载带到细胞, 并能快速穿过核膜, 到达并均匀分布于细胞核中, 发挥其清除自由基的功能, 直接保护DNA免受自由基的攻击。