核技术的应用是一把双刃剑, 在给人类带来巨大的益处的同时, 也存在较大的风险。很早国内外就开始了防辐射损伤药物的研究。近年来从中草药中分离和发现了许多具有抗辐射作用的药物成分^[1], 如茶多酚^[2]、多糖^[3]等。鞣质是存在于植物体内的一类结构比较复杂的多元酚类化合物^[4], 具有很强的抗氧化性, 能清除辐射产生的自由基, 保护机体组织免受辐射损伤。笔者初步探讨了薯莨和五倍子鞣质对γ射线损伤小鼠的防护作用, 以评估其用于辐射防护的应用前景。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康昆明种小鼠, 40只, 雄性, 体重19g~21g, 购自复旦大学实验动物中心, SCXK(沪)2007-0002。随机分为5组, 每组8只; 即:空白对照组、单纯照射组、茶多酚组、五倍子鞣质组和薯莨鞣质组。

1.2 药物与试剂

茶多酚(EGCG≥59)购自安徽红星药业有限责任公司, 五倍子鞣质和羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司, 薯莨鞣质由海军医学研究所生产(批号: 20101102)。茶多酚和五倍子鞣质用重蒸水配, 浓度均为10mg/ ml, 薯莨鞣质用0.5%羧甲基纤维素钠配制, 浓度为10mg/ml。

1.3 辐照方法

在第二军医大学辐照中心完成, γ放射源为⁶⁰Co。辐照实验开始前, 小鼠在海军医学研究所实验动物中心常规饲养7d, 自由摄食和饮水。照前2h及照后18h, 给药组按165mg/kg体重各灌胃给药1次, 空白对照组和单纯照射组用0.5ml0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。照射时, 小鼠置特制鼠笼限制活动, 距离放射源2.5m, 清醒状态下进行全身单次均匀照射, 吸收剂量率2.0Gy/min, 吸收剂量8.0Gy。空白对照组设置类似环境, 佯照射。辐照后, 常规饲养30d, 自由摄食和饮水。

1.4 小鼠行为观察及解剖

每天观察受照小鼠的活动、饮食和饮水等行为, 毛发、皮肤和眼睛等的变化, 每3天记录各组活存小鼠体重。对死亡小鼠进行解剖, 观察内脏变化, 分析死亡原因。

1.5 小鼠存活率、提高率及保护系数

参考文献[5, 6]介绍的方法, 观察小鼠生存情况, 记录每日小鼠死亡数, 并计算小鼠存活率、平均存活时间、提高率及保护系数K(K>1.2有意义)。

存活率=照后存活只数/实验只数×100%

提高率=实验组30d存活率-单纯照射组30d存活率

保护系数K=(ab+30c)/(a'b'+30c')

其中, K为保护系数, a为死亡鼠平均存活天数, b为死亡鼠数, C为30d存活只数, 分子为实验组, 分母为对照组。

1.6 统计学处理

数据均用SPSS11.0统计学软件处理, 组间应用配对t检验方法进行统计分析, P < 0.05有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况

与空白对照组相比, γ辐照小鼠4d后出现精神差, 活动、饮食、饮水减少, 体重减轻, 毛发失去光泽、蓬松、易脱落, 耳廓及尾部苍白, 部分小鼠出现单眼或双眼失明现象, 以单纯照射组最为明显。照后第9天小鼠开始出现死亡, 至19d后无小鼠死亡, 且活存小鼠体征开始好转。

2.2 受照小鼠存活率分析

空白对照组小鼠未发生死亡, 存活率为100%。单纯照射组小鼠自照后第9天出现小鼠死亡, 存活率持续下降, 至16d, 存活率为0。而给药组, 包括薯莨鞣质组、五倍子鞣质组和茶多酚组至照后18天保持较稳定的存活率, 分别为75%、62.75%和50%(图 1)。

2.3 平均存活时间

各组未死亡小鼠按30d计, 计算受照小鼠30d存活时间(图 2)。从图 2看出, 死亡小鼠的死亡时间集中在9~18d之间, 高峰为11~13d。单纯照射组小鼠在16d内全部死亡, 平均存活时间为(12.0±2.45)d。薯莨鞣质组、五倍子鞣质组和茶多酚组小鼠的平均存活时间分别为(26.25± 7.13)、(21.88±8.89)和(23.25±9.33)d。与单纯照射组比较存活时间差异存在统计学意义(P < 0.01或P < 0.05);而与空白对照组相比, 薯莨鞣质组和茶多酚组小鼠的平均存活时间无统计学意义(P>0.05)。

2.4 提高率与保护系数

各组小鼠照后30d的提高率及保护系数列于表 1。与单纯照射组相比, 茶多酚组、薯莨鞣质组、五倍子鞣质组小鼠生存提高率明显增加, 分别为62.75%、75.00%和50.00%, 保护系数均大于1.2, 其中薯莨鞣质组大于2, 这提示各药物对8.0Gy⁶⁰Coγ射线照射小鼠具有保护作用。

3 讨论

鞣质(tannin), 又称单宁, 是植物的次生代谢产物, 为一类结构比较复杂的多元酚类化合物, 广泛存在于植物界, 约70%以上的生药中含有鞣质类化合物。鞣质具有收敛及蛋白质凝固作用, 临床上用于各种止血, 止泻及抗菌抗病毒。近年来, 还发现鞣质具较强的还原性, 可清除生物体内的超氧自由基, 具有抗突变、抗脂质过氧化、延缓衰老、抗肿瘤和抗艾滋病等多种药理活性^[4]。本实验选用五倍子鞣质和薯莨鞣质初步探讨植物鞣质的抗辐射作用。五倍子(Galla chinensis)鞣质也称鞣酸或单宁酸, 可以治疗多种疾病, 如抗菌、抗病毒.清除自由基、抗氧化作用, 临床用于治疗腹泻、溃疡, 降低蛋白尿等作用^[7]。薯莨(Dioscoreae cirrhosae)鞣质为儿茶素类缩合鞣质, 临床上常用于止血、治疗溃疡、抗菌消炎, 也用于抗辐射、延缓衰老等^{[8, 9]}。

评价抗辐射药物的最简单最直接的方法就是观察实验动物辐照后的30d存活率及其平均存活时间。本实验中, 单纯照射组小鼠在照后16d内均鼠死亡, 存活率为0, 而薯莨鞣质组、五倍子鞣质组和茶多酚组的存活率分别为75%、62.75%和50%。薯莨鞣质组、五倍子鞣质组和茶多酚组小鼠的平均存活时间分别为(26.25±7.13)、(21.88±8.89)和(23.25±9.33) d, 与单纯照射组比较存活时间差异存在统计学意义(P < 0.01或P < 0.05)。给药组小鼠生存提高率也明显增加, 其保护系数均大于1.2。已有研究表明, 茶多酚具有多个酚羟基, 能够提供质子与辐射产生的自由基结合来消除机体内过量的自由基, 有较好的抗辐射作用^{[2, 10]}, 因此我们选用茶多酚作为阳性对照。与茶多酚组相比, 薯莨鞣质显然具有更好的抗辐射作用。

对实验中死亡的小鼠进行解剖发现, 其病理表现以渗出性病变为主, 主要是肺小血管扩张充血、肺出血、胃出血、肠道水肿有出血点, 肠壁变薄质脆。30天后处死小鼠并进行解剖发现, 与茶多酚组和五倍子鞣质组相比, 薯莨鞣质组的消化道状况较好, 这可能与其具有抗氧化和类似血小板的促凝作用有关, 但具体的机制还有待进一步研究。初步研究结果提示薯莨鞣质和五倍子鞣质有利于小鼠度过急性放射损伤期, 对8.0Gy ⁶⁰Coγ射线照射(剂量率2.0Gy/min)小鼠具有保护作用, 这为进一步开展辐射防护药物研究提供了很好的参考数据。