不同早熟凝集染色体方法对<sup>60</sup>Co γ射线照射的剂量-曲线影响的研究

2012, Vol. 21

Issue (2): 134-136 DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.02.028

引用本文

郭义曹, 杨浩贤, 杨宇华, 李禧娜, 黄伟旭, 郑巧玲. 不同早熟凝集染色体方法对⁶⁰Co γ射线照射的剂量-曲线影响的研究[J]. 中国辐射卫生, 2012, 21(2): 134-136. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.02.028.

GUO Yi-cao, YANG Hao-xian, YANG Yu-hua, LI Xi-na, HUANG Wei-xu, ZHENG Qiao-ling. Effects of Different Premature Chromosome Condensation Method on Dose-curve of ⁶⁰Co γ-Ray[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2012, 21(2): 134-136. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.02.028.

基金项目

广东省医学科学技术研究基金资助项目(A2008060)

通讯作者

郑巧玲, 主任技师, E-mail:qiaolingzheng@126.com

文章历史

收稿日期：2011-10-11

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不同早熟凝集染色体方法对⁶⁰Co γ射线照射的剂量-曲线影响的研究

郭义曹 , 杨浩贤 , 杨宇华 , 李禧娜 , 黄伟旭 , 郑巧玲

广东省职业病防治院, 广东广州 510300

收稿日期：2011-10-11

基金项目：广东省医学科学技术研究基金资助项目(A2008060)

作者简介：郭义曹(1953~), 男, 学士, 主任技师, 研究方向:辐射防护和实验室质量控制; E-mail:guoyicao@126.com.

通讯作者：郑巧玲, 主任技师, E-mail:qiaolingzheng@126.com.

摘要：目的研究早熟凝集染色体(PCC)方法学的常规法和改进后的方法对⁶⁰Co γ射线剂量-效应曲线影响, 为事故应急选择快速和准确的生物剂量估算方法。方法取3名23~28岁的男性肘静脉血, 在⁶⁰Co γ射线照射(0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 Gy, 吸收剂量率0.635 Gy/min)的条件下, 以常规PCC培养方法为对比; 比较2种方法(常规法和改进法)的50 h和60 h的2个培养时间所产生剂量-效应曲线的关系; 以另一实验室照射10.0 Gy(吸收剂量率0.670 Gy/min)所产生的PCC环结果, 用上述制作的剂量-曲线估算剂量作验证。结果 ① 常规50 h培养方法15.0、20.0 Gy点所获PCC细胞数不能满足统计学要求, 常规方法60 h、改进法50和60 h的3个培养方法收获的细胞数均可满足统计学要求, 故后3个方法均取作剂量曲线; ②后3个培养方法的PCC环与受照剂量的相关系数其系数间相当接近(均0.996以上、均p <0.01),直线回归方程成立,相关指数亦相当接近,剂量-效应拟合均为线性模式,回归系数间差异无统计学意义(P<0.05),回归直线的形态基本重叠;③验证:本研究的3条剂量-曲线估算受照10.0Gy的结果误差均≤8%,均符合生物学实验一般允许的15%。结论本研究的3个方法制作的3条曲线均可用于大剂量电离辐射损伤的生物剂量估算, 但以改进法的50 h培养速度快, 可作为事故应急首选的方法。

关键词：早熟凝集染色体(PCC) 方法学比较剂量-曲线估算事故应急

Effects of Different Premature Chromosome Condensation Method on Dose-curve of ⁶⁰Co γ-Ray

GUO Yi-cao , YANG Hao-xian , YANG Yu-hua , LI Xi-na , HUANG Wei-xu , ZHENG Qiao-ling

Guangdong Prevention and Treatment Center for Occupational Diseases, Guangzhou 510300 China

Corresponding author: ZHENG Qiao－ling. E-mail:qiaolingzheng@126.com .

Abstract: Objective To study the effect of traditional method and improved method of the premature chromosome condensation(PCC) on the dose-effect curve of ⁶⁰Co γ ray, for choosing the rapid and accurate biological dose estimating method for the accident emergency. Methods Collected 3 healthy male cubits venous blood (23 to 28 years old), and irradiated by 0, 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0 Gy ⁶⁰Co γ ray(absorbed dose rate:0.635 Gy/min). Observed the relation of dose-effect curve in the 2 incubation time(50 hours and 60 hours) of the traditional method and improved method. Used the dose-effect curve to verify the esposure of 10.0 Gy(absorbed dose rate:0.670 Gy/min). Results ① In the traditional method of 50-hour culture, the PCC cell count in 15.0 Gy and 20.0 Gy was of no statistical significance. But there were statistical significance in the traditional method of 60-hours culture and improved method(50-hour culture and 60-hour culture). Used the last 3 culture methods to make dose curve. ②In the above 3 culture methods, the related coefficient between PCC ring and exposure dose was quite close (all of more than 0.996, P < 0.01), the linear regression equation was established and the correlation index was quite close, the dose-effect curve was fitting the linear model. But there were no statistical significance among regression coefficient(p > 0.05), the morphology of regression straight lines almost overlap. ③Used the above 3 dose-effect curves to estimate the irradiation results(10.0 Gy), the error was less than or equal to 8%, all of them were within the allowable range of the biological experiment(15%). Conclusion The 3 dose-effect curves of the above 3 culture methods can apply to biological dose estimating of large doses of ionizing radiation damage. Especially the improved method of 50-hour culture, it is much faster to estimate and it should be regarded as the first choice in accident emergency.

Key words: Premature Chromosome Condensation Methodology Comparison Dose Curve Estimating Accident Emergency

早熟凝聚染色体(Premature Condensed Chromosome, PCC)技术应用中, 新发现的化学诱导剂花萼海绵体诱癌素A(CalyculinA,CA)可诱导外周血淋巴细胞在G1、G2及M期发生染色体凝聚,PCC技术可估算受照剂量至20Gy,对核和大剂量电离辐射事故的生物剂量估算有很大的帮助。但PCC常规方法制作的PCC形态粗短、不利于作为大剂量估算时的畸变指标(PCC环)的观察,而且受照剂量较大时,细胞生长出现阻滞。为了更快、更准确地使PCC技术应用于核和大剂量电离辐射事故的生物剂量估算,本课题的前期工作已对常规的PCC方法进行了改进并取得了较好的效果^[1],为了检验改进方法是否对剂量-曲线有影响,笔者研究了PCC常规法和本课题改进的方法对⁶⁰Coγ射线照射后的剂量-曲线结果,现报告如下。

1 材料和方法 1.1 材料

①血样:取近期无射线接触史、无病毒感染、不酗酒、经志愿和知情同意、年龄23~28岁的3名健康男性成人肘静脉血,根据实验的需要每人采血量为15至20ml。②主要试剂:胎牛血清和RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品;CA、细胞松驰-B(Cyt-B)、苦杏仁苷、秋水仙素均为美国Sigma公司产品;植物血凝素(PHA)为广州市达辉生物技术有限公司产品。

1.2 方法

血样经⁶⁰Coγ射线照射(0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0Gy,吸收剂量率0.635Gy/min)后,置37℃恢复培养2h,然后分装入培养基按本实验室的染色体微量全血培养法进行^[2]。即取全血0. 3ml加入盛有4ml混合胎牛血清、RPMI1640等组合培养基中培养、制片、吉姆萨染色;培养结束前2h按文献[3]的方法加入CA(终浓度50nmol/L)为常规的PCC培养方法;改进的方法学为开始培养前加入终浓度150mg/L苦杏仁苷和0.2mg/L的Cyt-B,培养结束前8h加入秋水仙素(根据预实验结果终质量浓度为30nmol/L),结束前2h加入和常规不同浓度的CA(35nmol/L)。比较常规法和改进法50h和60h的2个培养时间所产生的PCC环与剂量-效应曲线的关系;以另一实验室照射10.0Gy(吸收剂量率0.670Gy/min)所产生的PCC环结果,用上述制作的剂量曲线估算剂量作验证。分析细胞(G2和M期细胞)数按公式计算:应分析的细胞数=[(1-畸变率%)×96.04]/畸变率%,当畸变率≥100% (即平均每个细胞出现≥1个PCC环)时计数30~40个分析细胞。

1.3 统计分析

用Excel2003程序建立数据库,用相关系数、相关指数、剂量-效应拟合、直线回归方程等方法进行分析。

2 结果 2.1 不同培养方法的培养情况

常规方法的50h培养≤10.0Gy每个样本可收获50~500个G2+M期细胞,可满足统计学要求的分析细胞数,但15.0、20.0Gy点每人每个样本仅可收获0~6个G2+M期细胞,细胞数太少,本培养时间不作剂量-曲线制作;常规方法60h和改进法50h及60h的3个培养方法其收获细胞数均可满足要求,均取作剂量曲线,但PCC形态以改进法的较长,着丝点清晰,产生的PCC环可均清晰地观察,见图 1。

图 1 改进法的G2和M期PCC细胞

2.2 3个取作剂量-曲线的方法其PCC环结果

3个培养方法的各剂量点其PCC环结果均非常接近, 见表 1。

表 1 3个培养方法PCC环结果(PCC环/每细胞)

2.3 剂量-曲线制作

3个培养方法的PCC环与受照剂量的相关系数其系数间相当接近(均P < 0. 01), 回归直线方程成立, 相关指数相当接近, 剂量-效应拟合均为线性模式, 回归系数间差异无统计学意义(P < 0.05),见表2;回归直线的形态基本重叠(图 2)。

表 2 3种培养方法的相关系数、回归直线方程和估算结果

图 2 3条不同培养方法的曲线比较

2.4 验证

用本研究的3条剂量-曲线估算10. 0 Gy受照的结果(0. 724个环/PCC细胞), 其误差均≤8% (表 2),均符合生物学实验一般允许的15%,表示3个方法的曲线用于估算剂量均为允许范围内并且要比允许范围小得多,所估算的剂量也基本一致。

3 讨论

由于CA的一大特点是能诱导淋巴细胞染色体在G1、G2及M期产生PCC并可在此期间观察计数,故大大增加了PCC方法的应用价值。本研究的结果表明,选取的3种培养方法制作的剂量-曲线均可用于受照生物剂量估算,结果基本一致,说明改进的方法对剂量-曲线与常规法无差异。但以50h培养的改进方法学,其培养时间短、PCC形态良好,在大剂量的电离辐射下可快速获得良好的PCC标本, 可作为突发核和电离辐射事故发生时快速估算受照生物剂量的首选方法。

3.1 改进培养方法可缩短PCC的培养时间

由于PCC技术常应用于大剂量电离辐射的生物剂量估算^[4],受大剂量电离辐射时可使细胞生长受阻滞,改进的培养方法加入了2种细胞增殖促进剂(Cyt-B、苦杏仁苷), 可在大剂量电离辐射情况下比常规培养法的增殖速度要快, 对于应急时的快速估算受照生物剂量有重要的意义。改进法的50 h培养可作为应急时选用的首选方法。

3.2 本研究的3个方法学对剂量-曲线的生成无影响

本研究的改进方法学中加入了秋水仙素和2种细胞增殖促进剂, 可快速收获培养的细胞而且形态较好, 与常规法对比,3个方法得出的剂量-曲线估算剂量基本一致,而估算均有所偏高其原因可能是用于估算的照射吸收剂量率(0.670Gy/min)要稍高于用于曲线制作的吸收剂量率(0.635Gy/min),因在相同的照射剂量情况下吸收剂量率越大畸变率也越高。但同时也证明本研究制作的曲线较灵敏,稍有变化即可反应显示。

参考文献

[1]	郭义曹, 郑巧玲, 李禧娜, 等. 早熟凝集染色体技术在核事故应用中的方法学改进[J]. 中国辐射卫生, 2011(3): 275-277.
[2]	郑巧玲, 李来玉, 梁丽燕, 等. 207例职业性射线接触者的周围血染色体畸变和微核测定及分析[J]. 职业医学, 1992, 19(6): 368-369.
[3]	江波, 刘强, 姜恩海, 等. 花萼海绵体诱癌素A诱导早熟染色体凝集的方法学探讨[J]. 中国职业医学, 2007, 34(5): 373-375. DOI:10.3969/j.issn.1000-6486.2007.05.006
[4]	Hayata i, Kanda r, Minamihisamatsu M, et al. Cytogenetical dose estimation for 3 severely exposed patients in the JCO criticality accident in Tokai - mura[J]. J Radiat Res (Tokyo), 2001, 42(Suppl): S149-155. DOI:10.1269/jrr.42.S149