早熟凝聚染色体(Premature Condensed Chromosome，PCC)技术应用中，新近发展起来的用化学诱导剂花萼海绵体诱癌素A(Calyculin A，CA)诱导染色体发生凝聚，可诱导周围血淋巴细胞在G1、G2及M期发生染色体凝聚，与常规秋水仙素阻滞法(只观察M期分裂相)相比，可观察到细胞周期中不同阶段的染色体分裂相，对于核和大剂量电离辐射事故的生物剂量估算有很大的作用[1]。但常规的PCC法收获的标本中，PCC尚存在着丝点不清楚、形态粗短等不利于镜下分析的不足，为了更好地将PCC技术应用于核和大剂量电离辐射事故的生物剂量估算，本研究进行了PCC方法学的改进，现报告如下。
1 材料和方法 1.1 材料① 血样:取近期无射线接触史、无病毒感染、不酗酒、经知情同意、年龄20 ~ 32岁的健康成人肘静脉血，每人5 ml，每次实验用血均取自不同的人员，每次实验均取5人的血样。②主要试剂:胎牛血清和RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品; CA、细胞松驰-B(Cyt-B)、苦杏仁苷、秋水仙素均为美国Sigma公司产品; 植物血凝素(PHA)为广州市达辉生物技术有限公司产品。
1.2 方法以常规的PCC方法为标准[2]，通过对培养中加入CA、有丝分裂阻断剂秋水仙素来研究收获最佳的PCC形态与结构、长度; 通过改进制片步骤探索获取良好的PCC镜下分析标本; 在60Coγ射线大剂量照射的条件下通过加入Cyt-B和苦杏仁苷2种细胞增殖促进剂共同培养，研究其对促进周围血淋巴细胞增殖的作用。
1.2.1 培养中PCC的形态和长度改进方法为提高在核和大剂量电离辐射事故的生物剂量估算常用的畸变观察指标———PCC环的检出率[1]，本研究对染色体的长度的要求为:以D组染色体为例，其长度：宽度= 2.5 ~ 6.0：1。以常规的PCC方法为对比(加入CA为50 nmol·L-1) [2]，在本研究中拟单独加入CA或同时加入秋水仙素培养建立本研究方法。按本实验室的染色体微量全血培养法[3]，取全血0.3 ml加入盛有4 ml混合胎牛血清、RPMI1640等组合培养基中培养50 h，按常规法制片、吉姆萨染色。培养结束前8 h加入秋水仙素(根据预实验结果终质量浓度为30 nmol/L)，培养结束前2 h分别加入不同水平的CA来研究收获PCC的形态和长度。以收获细胞形态良好、符合上述长度：宽度比例要求的G2和M期细胞为可符合要求细胞，百分比例高者的实验为改进方法的优选。计算方法:符合要求的G2 + M期细胞百分率(%) = (符合要求的G2 + M期细胞/分析的G2 + M期细胞) × 100%。每一实验点分析5 000个G2和M期细胞; 处于细胞周期的G2和M期之间2条姊妹染色单体贴在一起的细胞被称为G2期细胞，2条姊妹染色单体明显处于分开状态的细胞被称为M期细胞。
1.2.2 制片方法的改进在常规制片法的基础上对低渗步骤的低渗液的用量、时间和温度进行改进; 在固定步骤对固定液的比例进行改进。以制出PCC良好的镜下畸变分析标本、收获符合上述长度：宽度要求的G2和M期细胞为可采用细胞，百分比例高者的实验为改进方法的优选。
1.2.3 对细胞增殖促进剂的研究从预实验中选定苦杏仁苷和Cyt-B为细胞增殖促进剂，先研究未照射样本的细胞增殖最佳促进浓度，再以此来研究电离辐射样本。按上述改进的方法，在确定细胞增殖最佳促进浓度后，用此浓度来研究电离辐射的结果。血样用60Coγ射线分别照射0 ~ 20 Gy后置37℃恢复培养2 h，然后分装培养50 h。培养开始时分别或同时加入不同水平的2种促进剂，得出结果和常规法(除不加促进剂外其他均相同)比较G2 + M期的细胞增殖情况。计算方法: G2 + M期细胞的增殖率(%) =[G2 + M期细胞数/观察细胞数(包括G1、S、G2、M期和转化的淋巴细胞)] × 100%，细胞增殖率最高者为最佳的细胞增殖促进剂浓度。60Co照射由中国人民解放军第421医院提供，吸收剂量率为0.635 Gy/min。
1.3 统计分析用Excel 2003程序建立数据库进行分析。
2 结果 2.1 培养方法改进后PCC的形态和长度的情况按“1.2.1”的方法进行实验，符合长度：宽度比例要求的细胞率常规法最低(20.6% ± 7.5%)、而且油镜下以结实粗短多见、着丝点较模糊; 以加入CA为35 nmol/L、秋水仙素30 nmol/L培养50 h收获的PCC形态挺直，结构良好、着丝点清晰，符合长度：宽度比例要求的细胞率最高(47.4%)，此为控制PCC的形态和长度的培养最佳浓度; 但各个实验浓度的制片均按方法常规法，PCC细胞整体不够“膨胀”，显示低渗不足的现象。
2.2 改进制片方法的结果为解决常规制片方法中存在低渗不足的现象，按上述最佳实验浓度的培养条件培养各实验号，经50 h培养后进行制片方法的改进。按表 1中的条件进行低渗处理; 固定的方法改为:每支试管每次加入8 ml固定液(甲醇：冰醋酸，按表 1中的比例)，固定2次。制片后，以“实验8”收获的可采用G2 + M期细胞率最高，见表 1。
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表 1 改进制片方法后收获可采用G2 + M期细胞率的情况 |
按预实验选定的2种细胞增殖促进剂，经分别研究获得2种促进剂的2个最佳质量浓度(表 2)，用这2个浓度按“实验8”的方法进行实验。血样用60Coγ射线分别照射后50 h培养，以同时加入苦杏仁苷+ Cyt-B的“实验14”效果最好(表 2)，并且各期细胞中油镜下大、小PCC环均清晰可见，很容易辨认，见图 1、2。
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表 2 2种细胞增殖促进剂对不同剂量60Coγ射线照射后G2 + M期细胞增殖率(%) |
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图 1 G2期细胞，有2个PCC环分别穿套在2奈染色体内.另有1个小环 |
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图 2 M期细胞，图乍各有1个大、中和小的PCC环 |
在最新PCC技术的发展中，CA的发现给PCC技术带来新的生命力。由于CA的一大特点是能诱导淋巴细胞染色体在G1、G2及M期产生PCC并可在此期间观察计数，故大大增加了PCC方法的应用价值。但PCC常规法加入CA收集细胞的时间短(1 ~ 2 h，因CA有一定的毒性)、浓度较高，染色体较粗短，不利于对PCC环等畸变的判断，而且收集到的细胞数目也相对少，不利于快速检测。本研究的方法学改进，其方法简便、在大剂量的电离辐射下可快速获得良好的PCC标本，为应用于突发核和电离辐射事故发生时快速估算受照的生物剂量提供了很大的帮助。
3.1 改进培养方法对PCC形态和长度的意义本研究在对常规方法的培养改进中除了减少CA的加入外，还提前加入低浓度的秋水仙素，其目的有二:主要是加入秋水仙素后细胞形态“挺直”(和常规染色体畸变分析基本一致)，长度、结构良好，着丝点清晰，克服了CA浓度高时染色体形态粗短、浓度低时出现多个弯曲、“柔弱”、不利于畸变判断的现象; 次要是收集较早到达M期的分裂细胞。而秋水仙素收获到的M期细胞并不影响观察结果，因为经过复制后的G2和M期细胞，一般来说其结构畸变是稳定的，而且CA本身也收集M期细胞，因此，在实验中加入秋水仙素也可视为协同CA收集较早到达M期的细胞，但当受照剂量较大时，由于细胞生长受阻滞，收获到的绝大多数为刚通过复制期的G2期细胞，因此这种作用也趋于消失。
3.2 改进制片方法可使PCC的形态达到良好的状态由于PCC技术常应用于大剂量电离辐射的生物剂量估算[1]，大剂量电离辐射时产生的畸变也相应复杂。因此，理想的标本状态可能较大程度地防止畸变的漏检。本研究在开始时应用常规的制片方法，显得低渗不足，使细胞“膨胀”未达到理想的状态，影响观察结果，经过对影响低渗的各因素实验的改进，并同时对固定液比例的改进，可使PCC形态达到较理想的状态，如图 1、2中，小的PCC环也能清楚观察; 而如用常规的制片方法这种小环未被充分膨胀，未达到低渗的“放大”作用，可能被误认为是其他染色较深的物质，最终被排除畸变。
3.3 大剂量电离辐射情况下细胞增殖促进剂的作用在大剂量电离辐射情况下，需要对伤员的生物受照剂量快速估算。因此，快速的增殖培养是快速估算的一个途径，本研究应用的2种细胞增殖促进剂在大剂量电离辐射情况下比常规培养法的增殖速度要快，值得深入研究。
| [1] |
Hayata I, Kfanda R, Minamihisamatsu M, et al. Cytogenetical dose estimation for 3 severely exposed patients in the JCO criticality accident in Tokai-mura[J]. J Radiat Res (Tokyo), 2001, 42(Suppl): S149-155. DOI:10.1269/jrr.42.S149 |
| [2] |
江波, 刘强, 姜恩海, 等. 花萼海绵体诱癌素A诱导早熟染色体凝集的方法学探讨[J]. 中国职业医学, 2007, 34(5): 373-375. DOI:10.3969/j.issn.1000-6486.2007.05.006 |
| [3] |
郑巧玲, 李来玉, 梁丽燕, 等. 207例职业性射线接触者的周围血染色体畸变和微核测定及分析[J]. 中国职业医学, 1992, 19(6): 368-369. |