氡是一种普遍存在于环境空气中的天然放射性气体，是一类不可忽视的呼吸系统放射性污染物。氡衰变过程中产生氡子体并且释放α粒子，可以被人和动物吸入，沉积在各级呼吸道[1]。α粒子具有较高的能量(5. 49~7. 69 MeV)，对支气管上皮基底细胞、粘液细胞及肺上皮细胞等靶细胞具有较强的生物学效应[2, 3]，可引起DNA损伤、基因突变、细胞染色体畸变，甚至是肿瘤的发生[4]。流行病学调查显示长期在氡(222Rn)浓度较高的矿井作业的矿工罹患肺癌的危险性将会增加，去除吸烟因素后，随着氡及其子体暴露量的不断增大肺癌发病率也明显增加。Taeger[5]等对德国铀矿工肺癌死亡调查分析中认为铀矿工肺癌死亡率是德国东部地区普通人群的2. 9倍。因此，氡及其子体对人类和其他生物所造成的健康危害及其作用机制，成为近年来放射生物学领域的关注热点。本实验通过建立氡染毒小鼠肺损伤模型，检测肺组织细胞凋亡及凋亡相关的p53、Bcl-2和Bax蛋白表达的变化，探讨氡吸入染毒导致肺细胞凋亡的机制。
1 材料与方法 1.1 动物分组与氡染毒模型的建立SPF级，2周龄，雄性BALB/c小鼠120只，体重18~22g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号: SCXK(军) 2007-004，温度(22 ± 2) ℃，湿度: 40%~70%，常规饲养。小鼠随机分为实验组和对照组，分别研究氡染毒不同剂量(30和60WLM，每组10只)以及染毒60WLM后不同时期(24h，30d，90d和180d，每组10只)肺组织的病理学改变及肺组织中p53表达变化。小鼠的氡吸入染毒在中国计量科学研究院电离辐射与医学研究所SR-NIM02型氡室内进行，氡室条件、氡浓度实时监测方法及染毒剂量的计算均与文献[6]相同。
1.2 TUNEL法检测凋亡取肺右叶及相连的支气管，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，将石蜡切片进行常规脱蜡脱水，严格按TUNEL试剂盒(Promaga)说明书进行。光镜下分析结果，400 ×倍数下每张片子取10个视野，100个细胞中阳性细胞数，棕黄色为阳性，计算凋亡细胞数占总细胞数的百分比为凋亡指数。
1.3 免疫组织化学法检测蛋白表达量采用非生物素二步法免疫组化检测肺组织p53、Bcl-2和Bax蛋白的表达。石蜡切片常规脱蜡、脱水、热修复，一抗稀释均为1: 100，4℃过夜。二抗37℃孵育30min，DAB显色，复染，显微镜下观察。设阳性和阴性对照。p53表达阳性为胞核棕黄色，bcl-2和bax表达阳性为胞浆棕黄色。每张切片10个视野，计数100个细胞中阳性细胞数，取均值，以百分数(%)表示。
1.4 统计学处理分析采用SPSS 12. 0软件进行t检验，实验结果数据以
TUNEL法检测显示在氡染毒30WLM、60WLM染毒组肺组织细胞凋亡指数明显高于正常对照组，30WLM组和60WLM组之间无明显的差异; 每个剂量组随着染毒时间的延长细胞凋亡数也呈上升趋势，90d时明显增高。见表 1。
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表 1 不同染毒组不同时间段肺组织的细胞凋亡指数 |
免疫组化检测小鼠肺组织p53蛋白表达情况，30WLM、60WLM染毒组肺组织p53蛋白表达阳性率明显高于正常对照组; 各个剂量组随着时间的延长p53阳性细胞数逐渐增加，染毒后90d达高峰。见表 2。
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表 2 不同染毒组不同时间段小鼠肺组织p53蛋白表达的情况 |
免疫组化检测小鼠肺组织Bcl-2/Bax蛋白表达情况，与正常对照组相比，随着剂量的增加Bcl-2/Bax比值明显下降; 随着染毒后时间的延长肺组织Bcl-2/Bax比值呈下降趋势。见表 3。
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表 3 不同染毒组不同时间段小鼠肺组织Bcl-2/Bax比值的变化 |
氡引起肺损伤甚至是肺癌，是一个逐步的渐进的过程，其发病机制复杂，细胞凋亡是其中一个重要方面。细胞凋亡相关基因及其调控基因均与恶性肿瘤发生、发展及预后有着密切的联系。本研究采用TUNEL法检测不同剂量氡吸入染毒后不同时间段的小鼠肺组织细胞凋亡情况。氡吸入染毒后细胞凋亡的百分率随着氡吸入累积剂量的增加而增加，在累积剂量达到30WLM和60WLM时与对照组相比，随着小鼠的病理变化的显著，小鼠肺细胞凋亡率也明显增加。
氡及其子体主要随着人及动物的呼吸而黏附在呼吸道上，对支气管和肺泡起内照射作用，其作用特点为作用时间的持续性和作用时间的累积性。研究证实，放射性核素诱发的细胞凋亡与其生物学特性有关。通过研究，147Pm (钷)内照射诱发Molt-4细胞和Ana-1细胞死亡方式，表明147Pm诱发的细胞死亡具有典型的凋亡形态学特征，细胞凋亡的程度及DNA链断裂量与147Pm作用的时间和内照射的累积吸收剂量有关，提示放射性核素147Pm内照射可诱发细胞凋亡[7]。朱寿彭等[8]用活度为3. 7 × 105 Bq/ml的153Sm-EDTMT(153Sm-乙二胺四甲撑膦酸)对骨肉瘤细胞(H03-8603)进行内照射处理，发现153Sm也可诱导细胞凋亡，其凋亡程度与内照射的作用时间有关。随着氡染毒后饲养时间的增加，氡及其子体对小鼠肺组织的作用时间长，因此，氡染毒小鼠肺组织细胞凋亡率随着时间的增加明显增高。本研究检测在氡染毒后不同时间段小鼠肺组织细胞凋亡率，发现染毒30和60WLM剂量组小鼠肺细胞凋亡率随着时间的延长呈上升趋势，染毒后90d小鼠肺细胞凋亡率最高，与氡染毒后24h处理组有明显的差异。推断氡染毒小鼠吸入氡及其子体后，可沿着呼吸道聚积在肺泡壁上，放射出的α射线使细胞受损，并可能通过细胞凋亡通路，启动一系列程序性死亡过程引起肺细胞凋亡。
辐射诱发细胞凋亡的机制大致符合其他因素诱发细胞凋亡的机制。大量文献报道认为，p53通常和mdm2蛋白相互作用保持在较低水平。辐射致使DNA损伤后，由于ATM、ATR和DNA-PK等的作用，使p53基因激活，经一系列下游基因作用，包括caspases级联反应、细胞周期阻滞、DNA修复或细胞凋亡[9]。目前认为，DNA损伤不能修复，则通过p53介导途径，使细胞发生周期阻滞或细胞凋亡。Bcl-2/Bax基因在辐射所致细胞凋亡过程中起着重要作用。辐射通过促进Bax基因表达，改变Bcl-2/Bax比值而诱发细胞凋亡。本研究通过免疫组化方法检测各组p53蛋白的表达量，发现正常对照组p53蛋白表达量较低，氡染毒小鼠肺组织p53蛋白量明显增高，差异具有统计学意义。小鼠经氡吸入染毒30、60WLM，随着染毒后饲养时间的增加，p53蛋白阳性率明显增加。90d时达到峰值。这种变化与氡染毒小鼠肺组织病理变化及肺细胞凋亡指数的变化规律相重合。可能是因为氡染毒后引起了肺损伤，并启动了p53通路及其他细胞凋亡通路，从而抑制细胞恶化。
Bcl-2和Bax基因是近年来发现的一对关系密切的凋亡基因，在细胞凋亡调控中起重要作用。Bcl-2抑制细胞的凋亡，Bax则促进细胞凋亡。本研究观察了氡吸入染毒后小鼠肺组织Bcl-2及Bax蛋白的表达变化，氡吸入染毒后24h、30d和90d均出现了随着剂量的增加Bax表达明显增加，而且随着染毒后时间的增加，Bax表达亦出现了显著的增加; Bcl-2则随着氡染毒剂量及染毒后时间的延长呈下降趋势; Bcl-2/Bax比值在氡染毒后不同阶段随着剂量的增加明显降低; 每个剂量组随着时间的延长Bcl-2/Bax比值呈下降趋势。相关研究证实，Bcl-2和Bax在细胞内是以同源二聚体或异源二聚体形式存在的。当Bax过表达时，形成同源二聚体Bax/Bax，促进细胞凋亡; 当Bcl-2过表达时，形成异源二聚体Bcl-2/Bax，抑制细胞凋亡。Bcl-2/Bax比值的变化调节着细胞增殖和凋亡的平衡[10]。因此，Bcl-2与Bax形成异源二聚体是其调节细胞凋亡的必要条件，而Bcl-2/Bax比值对决定细胞命运起关键作用，在正常情况下Bcl-2/Bax保持一定比例，并以Bcl-2/Bax异源二聚体形式存在，维持细胞正常数量和寿命。当Bax增加，Bax同源二聚体形成增加，Bcl-2/Bax比值下降，便诱导细胞凋亡[11, 12]。推测，可能是随着氡染毒后小鼠肺组织的损伤加重，启动了细胞凋亡的通路，p53基因的增加，促进了促凋亡基因Bax表达增加，抑制凋亡基因Bcl-2表达降低，增加Bax同源二聚体的形式，下调Bcl-2/Bax比值而促进肺细胞凋亡。
细胞凋亡是非常复杂的网络状信号转导调控模式，涉及到很多基因，因此，氡染毒小鼠肺细胞凋亡的机制有待于我们更深入的研究证实。
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