中国辐射卫生  2010, Vol. 19 Issue (2): 143-144  DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2010.02.001

引用本文 

张恒, 吴红英, 李德冠, 王月英, 王小春, 杜利清, 路璐, 张俊伶, 孟爱民. 电离辐射对小鼠脾脏B淋巴细胞损伤的研究[J]. 中国辐射卫生, 2010, 19(2): 143-144. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2010.02.001.
ZHANG Heng, WU Hong-ying, LI De-guang, et al. The Study of Ionizing Radiation on Proliferation of Mouse Spleen B Lymphocyte[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2010, 19(2): 143-144. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2010.02.001.

基金项目

国家自然科学基金(30770645);天津市自然科学基金(08JCYBJC07300);中国医学科学院放射所基金(SF0825)

通讯作者

孟爱民, 研究员, 博士生导师

文章历史

收稿日期：2009-09-25
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
电离辐射对小鼠脾脏B淋巴细胞损伤的研究
张恒 , 吴红英 , 李德冠 , 王月英 , 王小春 , 杜利清 , 路璐 , 张俊伶 , 孟爱民     
中国医学科学院放射医学研究所, 天津市分子核医学重点实验室, 天津 310192
收稿日期：2009-09-25
基金项目：国家自然科学基金(30770645);天津市自然科学基金(08JCYBJC07300);中国医学科学院放射所基金(SF0825)
作者简介：张恒(1975~), 男, 助理研究员, 研究方向:实验动物病理学、放射医学.
通讯作者：孟爱民, 研究员, 博士生导师.
摘要：目的 探讨电离辐射对小鼠脾细胞活性的影响, 阻断p38-MAPK通路对小鼠脾细胞的防护作用。方法 从体内、体外实验研究不同剂量电离辐射对小鼠脾细胞活性的影响, 分别在照射前、后给与p38 MAPK通路阻断剂SB203580, 观察对辐射损伤的防护和治疗作用。结果 在体外实验中, 辐射对小鼠脾细胞活性的破坏作用与剂量正相关; 体内实验表明低剂量的辐射可以提高脾细胞的活性, 高剂量辐射能破坏其活性; 在亚致死剂量的辐射下, 照射后用SB203580对小鼠脾细胞活性的治疗作用不明显, 照射前用SB203580对小鼠脾细胞活性具有较好的保护作用。结论 阻断p38-MAPK通路可以有效预防辐射对小鼠脾细胞的损伤, 无明显的治疗作用。
关键词：电离辐射    P38-MAPKs    脾细胞增殖    
The Study of Ionizing Radiation on Proliferation of Mouse Spleen B Lymphocyte
ZHANG Heng , WU Hong-ying , LI De-guang     
Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Tianjin 300192 China
Abstract: Objective To study the effect of ionizing radiation on mouse spleen B lymphocytes proliferation and the protective effect by inhibiting p38-MAPK signal transduction pathway. Methods To observe the ionizing radiation with different doses on mouse spleen cells in vivo and vitro and before and after radiation, inject SB203580 on mice and analyze the protective or therapeutic effect on them. Results In vitro, ionizing radiation can impair mouse spleen cells proliferation, while in vivo, low doze ionizing radiation can enhance mouse spleen cell proliferation and high dose can hurt it.Exposed in sublethal dose ionizing radiation, mouse spleen could be protected by using SB203580. Conclusion Inhibting p38-MAPK pathway can protect mouse spleen cells from being damaged by ionizing radiation.
Key words: Ionizing Radiation    MAPKs    Spleen Cells Proliferation    

脾脏是机体最大的免疫器官, 含大量淋巴细胞, 以B淋巴细胞为最多, 主要分布在脾小体边缘区和红髓。淋巴细胞具有很高的辐射敏感性, 其中B细胞较T细胞具有更高的照射后凋亡敏感性。B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体, 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。脂多糖(LPS, 对小鼠有作用)可刺激B细胞发生增殖, B淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段, 是衡量机体体液免疫力的重要指标。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen -activated protein kinases, MAPKs)是一类在脊椎动物体内广泛存在的细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 其参与的细胞内激酶级联反应是细胞外界信号传递到细胞核内、调节基因表达的重要通路。MAPKs包括3个主要的亚家族:细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK。p38是1994年由Han等发现的一种38kD的酪氨酸磷酸化蛋白激酶, 由360个氨基酸组成, p38-MAPK通路的活化与细胞的凋亡和细胞周期调节密切相关[1]。本研究拟从体内、体外实验, 研究不同剂量电离辐射对小鼠脾细胞活性的影响, 探讨阻断p38MAPK通路对小鼠脾细胞的防护和治疗作用。

1 材料和方法 1.1 试剂、材料和仪器

淋巴细胞分离液(Ficoll), 天津美德太平洋科技有限公司。Celltiter-Glo, Promega, Cat.G756B, Lot.19681810。LPS, Sigma; SB203580, LCLab, cat.s-3400, Lot.arv-107。RPMI-1640, Solarbio, cat.31800-500, Lot. 215445。胎牛血清, Biovision, cat.04-001-1A, Lot.215445。CO2培养箱, Heraells。多功能酶标仪, TECAN, InfiniteM200。137Csγ射线照射源, 加拿大原子能有限公司, 型号USD, Autocell40, 剂量率0.82Gy/min。Eppendorf离心机, 型号5810R。

1.2 实验动物

C57BL/6小鼠, 雄性, 21~23g, 购自维通利华, 合格证号:SCXK (京)2008-0003。

1.3 实验方法 1.3.1 体外实验

取C57BL/6小鼠4只称重, 颈椎脱臼法处死, 常规消毒后, 在超净工作台中无菌取出脾脏, 称重后置含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中, 制取脾细胞悬液后Ficoll分离, 台盼蓝鉴定细胞活性(在95%以上), 计数后用RPMI-1640培养液调细胞浓度为2 ×106/ml备用。用0、1、4Gy剂量的γ射线照射后6h后进行脾细胞增殖实验, 细胞悬液加入96孔板, 每孔100μl, LPS刺激组加入用1640液稀释的10μl/mlLPS100μl, 对照组加入1640液100μl, 于37℃培养48h后加入Celltiter-Glo震荡孵育10min转入96孔白板, 多功能酶标仪检测发光值(luminescence功能, Integration1000ms)。刺激指数(S.I.)计算方法:

1.3.2 体内照射实验

取C57BL/6小鼠24只分3组, 分别用0、4、6Gy剂量的γ射线照射, 1天后脱颈处死, 无菌条件下取脾细胞, 制成2 ×106/ml单细胞悬液进行脾细胞增殖实验(方法同上)。

1.3.3 体内药物防护实验

取C57BL/6小鼠32只, 分对照组(Ctr组)、照射对照组(IR组)、药物治疗组(SB-C组)和药物预防组(SB-P组)。SB-P组于照射前0.5h按15mg/kg皮下注射SB203580工作液, 后3组用7.2Gy剂量的γ射线照射, SB -C和SB-P组照射24h后腹腔给药, 隔日1次, 共5次, Ctr组和IR组于相同时间皮下注入等量DMSO液; 照射15d后处死小鼠, 取脾细胞进行脾细胞增殖实验, 方法同上。

1.4 统计学处理

数据处理用SPSS11.5版软件包进行分析, 检测结果以x±s表示, 经Levene检验后, 采用LSD法检验比较组间差异, P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 体外实验

在体外实验中, 电离辐射能够显著降低小鼠脾细胞的增殖能力, 1Gy和4Gy组均较对照组显著下降(P < 0.05), 1Gy和4Gy组间差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 1。

图 1 不同剂量辐射体外实验对小鼠脾细胞增殖能力影响
2.2 体内照射实验

实验结果显示, 在电离辐射急性期, 小鼠脾脏功能受到影响, 4Gy组S.I.值较对照组增高93.1%, 6Gy组较对照有所降低, 没有统计学意义(P>0.05), 较4Gy组降低53.9%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 2。

图 2 体内急性期不同剂量辐射对小鼠脾细胞增殖能力影响
2.3 体内药物防护实验

在体内药物防护实验中, 采用亚致死剂量的γ射线对实验小鼠进行了照射, 实验中有近半数的照射小鼠死于胃肠道损伤。由存活的小鼠研究发现, 小鼠经亚致死剂量电离辐射后脾细胞增殖能力下降, SB203580治疗后其增殖能力有所上升, 但较照射组无统计学意义差异, SB203580预防组较照射组增高77.7%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 3。

图 3 体内SB203580干预实验
3 讨论

由图 1可见, 在体外实验中, 电离辐射可以降低小鼠脾细胞免疫活性, 随照射剂量增大其损害作用增强, 其原理可能在于:电离辐射可以直接破坏DNA双链, 导致细胞凋亡[2]; 电离辐射可在细胞内产生大量活性氧, 诱发细胞凋亡[3]。由图 2的数据表明, 在体内实验时的情况与体外实验不同, 在4Gy剂量时脾细胞的活性反而增强, 6Gy剂量时脾细胞活性较4Gy时显著下降, 而与对照组处于相同水平, 这一结果与KlokovD等[4]的研究结果相似。其原因在于当脾脏受到低剂量辐射时, 可引起免疫应答的发生, 脾的体积和内部结构也发生变化, 使脾脏成为具有一定辐射保护作用的免疫应答场所[5]。

SB203580预防组较照射组的S.I.值升高77.7%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。活化的P38可以直接磷酸化P53, 磷酸化的P53不能被其抑制蛋白HDM2结合和降解, 因此含量增高, 能活化靶基因P21WAF1的转录, 有效地将细胞周期阻滞在G1、G2期[6]。P21与周期蛋白-CDK复合物结合, 可以抑制CDK1、2、4的活性使细胞阻滞与G2/M关卡处[7]。可见, 阻断p38-MAPK通路后, 可以降低各级造血细胞所处G2/M期的比例, 提高G1/0期的比例, 而细胞处于G2/M期对辐射较敏感, 处于G1/0期时对辐射的耐受力较强。所以, 我们认为, 应用SB203580可以预防辐射对小鼠脾细胞的损伤, 从而提高机体的体液免疫力。

在今后的研究中, 我们将对P38-MAPK通路的上游活化因子和下游与细胞周期、细胞凋亡的相关效应蛋白进行深入研究, 并探讨该通路与TGF-beta/Smads、P53等细胞信号传导通路的交互作用, 为临床应用提供更多依据。

致谢: 常建辉, 翟志斌, 刘金剑, 王彦, 褚丽萍等为我们提供的帮助。

参考文献
[1]
Han J, Sun P. The pathways to tumor suppression via route p38[J]. Trends Biochem Sc, 2007, 32: 364-371. DOI:10.1016/j.tibs.2007.06.007
[2]
Mognato M, Girardi C, Fabris S, et al. DNA repair in modeled microgravity:double strand break rejoining activity in human lymphocytes irradiated with gamma-rays[J]. Mutat Res, 2009, 26(1-2): 32-39.
[3]
Liu Q, He X, Liu Y, et al. NADPH oxidase-mediated generation of reactive oxygen species: A new mechanism for Xray-induced HeLa cell death[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 377(3): 775-779. DOI:10.1016/j.bbrc.2008.10.067
[4]
Klokov D, Criswell Sampath L, et al. Clusterin:a protein with multiple functions as a potential ionizing radiation exposure marker[J]. Radiation Life Sciences, 2003, 16(24): 219-32.
[5]
Yang ZW, Li JA, Yang MH, et al. Comparison of blood counts in splenic, renal and mesenteric arterial and venous blood in post-pubertal rabbits[J]. Res Vet Sci, 2005, 79(2): 149-154. DOI:10.1016/j.rvsc.2004.11.008
[6]
el-DeiryWS, Harper JW, O'Connor PM, et al. WAF1/CIP1 is induced in p53-mediated G1 arrest and apoptosis[J]. Cancer Res, 1994, 54: 1169-1174.
[7]
Chen WJ, Chang CY, Lin JK. Induction of G1 phase arrest in MCF human breast cancer cells by pentagalloylglucose through the down-regulation of CD K4 and CD K2 activities and upregulation of the CD K inhibitors p 27(Kip) and p 21(Cip)[J]. Biochem Pharmacol, 2003, 65: 1777-1785. DOI:10.1016/S0006-2952(03)00156-4