人乳铁蛋白(human lactotransferrin hLTF, human lactoferrin hLF)是铁结合蛋白, 在人乳汁中含量最高。hLF具有抗菌和抗病毒活性[1], 最近发现hLF可抑制肿瘤形成[2]。hLF可能通过激活NK细胞或提高NK靶细胞对于NK细胞的敏感性来抑制肿瘤形成[3]。促进IL、IFN等细胞因子的表达, 进而激活免疫机体细胞功能[4]。
1 材料与方法 1.1 材料及主要试剂pBC1-hLF载体由本实验室构建, 人乳腺癌细胞MCF7细胞购自中国医学科学院细胞中心。Celltiter-Glo试剂盒(G756B)购自Promeg, 脂质体LipofectamineTM 2000以及引物合成和测序服务由Invitrogen提供。小鼠抗hLF单抗购自Abcam, hLF标准品购自Sigma (61326), 二抗购自北京中杉金桥。质粒pMD19T、pBluescript SK(+)、PCR试剂盒购自Takara公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养和转染MCF7细胞10%胎牛血清的1 640培养基培养称MCF7对照组; 向培养基中添加hLF至10μM处理24h称hLF处理组; 选择指数生长期的MCF7细胞, 消化计数按1.0 ×106接种6孔板中, 每孔3ml10%胎牛血清的1 640培养基培养。至细胞90%融合后改用无血清Opti-MEM培养, 按Lipofectamine说明书转染, 12h后转用含10%胎牛血清的1 640培养基培养称pBC1-hLF转染组。
1.2.2 Western印记检测hLF表达水平检测样品经SDS / PAGE (10%分离胶, 4%浓缩胶)电泳后, 半干转PVDF膜行蛋白印记检测, 一抗1: 10 000稀释, 二抗1: 2 000稀释, ECL显色显影, 内参β-actin, 结果见图 1。
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图 1 MCF7细胞pBC1-hLF转染后hLF的表达 |
细胞贴壁于培养瓶中, 照射时反置培养瓶, Ce137辐射仪0.82 Gy /min照射2, 4, 8Gy。
1.2.4 细胞活性实验将各组受照细胞以每孔10 000个转移至不透光96孔板, 按照Celltiter说明书操作, 荧光发光仪读板, 积分时间0.25s, 记录数据作存活曲线图。
1.2.5 流式细胞凋亡检测选择指数生长期的细胞, Ce137照射2, 4, 8Gy后, 70%乙醇4℃固定, 分析前PBS洗细胞2次, 再分散, 加1mlPI工作液(PBS, 0.5mg /mLRNase, 0.1mg /mL propidium iodide), 流式检测细胞周期分步和亚G1凋亡峰。结果图 2。
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图 2 受照细胞存活曲线 |
选择指数生长期的各组细胞室温照射不同剂量后, 梯度稀释接种60mm培养皿, 100个细胞每皿加10ml预热的培养基, 培养至肉眼可见克隆时终止培养(约2 ~ 3周), 甲醇固定15min, 姬姆萨染色15min, 洗去染色液干燥后显微镜下计大于50个细胞的克隆, 计算克隆形成率。
2 结果 2.1 Western印记检测hLF表达水平图 1显示pBC1-hLF转染组24h的hLF表达比对照组增加。
2.2 细胞活性实验显示hLF处理组和与对照组比较存活率无显著差异pBC1-hLF转染组的受照存活率显著下降(P < 0.05), LD50分别为:对照组2.73; hLF处理组2.85; hLF转染组2.22。与对照组比较辐射增敏率分别为hLF处理组0.96和pBC1-hLF转染组1.23。
2.3 流式细胞凋亡检测图 3显示各组细胞受照后凋亡率的变化, 无统计学意义。与对照组和hLF处理组比较, pBC1-hLF转染组的凋亡率则显著升高(P < 0.001)。
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图 3 受照细胞凋亡实验 |
图 4显示各组细胞受照后克隆形成能力的变化, hLF处理组和与对照组比较克隆形成无显著差异, 但有升高的趋势。pBC1-hLF转染组与对照组和hLF处理组比较, 照射后克隆形成均显著下降(P < 0.001)。
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图 4 受照细胞克隆形成实验 |
对于hLF可能的抗肿瘤作用目前的报道有限, 而hLF与辐射敏感性的研究报道还未见。Zhou等从鼻咽癌的分子流行病学研究发现hLF可能是抑癌基因, 在体外可下调细胞周期蛋白Cyclin D1, 上调周期抑制蛋白p21、p27, 将细胞阻滞于G0/G1期, 协同调节MAPK通路来发挥抑制增殖作用[5]。Xiao等报道用hLF处理体外头颈部癌细胞可以激活细胞周期监控点蛋白p27和Cyclin E协同部分Akt通路功能, 导致G0/G1周期阻滞, 抑制细胞增殖[6]。为探讨hLF对于人乳腺癌细胞MCF7辐射敏感性的影响, 我们用pBC1-hLF载体转染MCF7细胞, 同时以培养基中加hLF标准品处理为参照, 观察hLF基因高表达对细胞生长特性和对于辐射的敏感性的影响。细胞活力实验说明hLF基因的高表达可以显著抑制MCF7的生长, 提高其对射线的敏感性, 但是直接加入hLF标准品处理对于MCF7细胞却没有抑制作用和辐射增敏作用。凋亡检测和克隆形成试验显示hLF基因的高表达可以促进MCF7细胞受照后的凋亡, 降低克隆形成能力, 但直接加入hLF标准品处理对于MCF7细胞也没有显著凋亡诱导作用, 反而有促进克隆形成的趋势。由于MCF7细胞自身就可以表达hLF, 因而存在于细胞外的hLF可能主要起营养作用, 从而促进了细胞增殖。另一方面, 在细胞内表达的hLF可能无需跨膜运输入胞就直接激活抗肿瘤信号通路, 产生诱导凋亡和抑制生长的效应。上述关于hLF对于人乳腺癌MCF7细胞辐射敏感性影响的初步研究结果, 提示hLF基因表达的空间分步位置和时间顺序不同可能导致其在不同的肿瘤组织细胞发挥不同的作用, 这需要我们继续更加深入的研究hLF基因肿瘤抑制作用的可能机制。
| [1] |
Hiroyuki Wakabayashi, Koji Yamauchia, Mitsunori Takasea. Lactoferrin research, technology and applications[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(11): 1241-1251. DOI:10.1016/j.idairyj.2006.06.013 |
| [2] |
Rodrigues L, Teixeira J, Schmitt F, et al. Lactoferrin and cancer disease prevention[J]. Crit Rev Food Sci Nutr., 2009, 49(3): 203-217. |
| [3] |
Bezault J, Bhimani R, Wiprovnick J, et al. Human lactoferrin inhibits growth of solid tumors and development of experimental metastases in mice[J]. Cancer Res., 1994, 54: 2310-2312. |
| [4] |
Iigo M, Alexander DB, Long N, et al. Anticarcinogenesis pathways activated by bovine lactoferrin in the murine small intestine[J]. Biochimie., 2009, 91(1): 86-101. DOI:10.1016/j.biochi.2008.06.012 |
| [5] |
Zhou Y, Zeng Z, Zhang W, et al. Lactotransferrin:a candidate tumor suppressor-Deficient expression in human naso-pharyngeal carcinoma and inhibition of NPC cell proliferation by modulating the mitogen-activated prote in kinase pathway[J]. Int J Cancer, 2008, 129(9): 2065-2072. |
| [6] |
Xiao Y, Monitto CL, Minhas KM, et al. Lactoferrin down regulates G1 cyclin-dependent kinases during growth arrest of head and neck cancer cells[J]. Clin Cancer Res., 2004, 10(24): 8683-8686. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-04-0988 |