壳聚糖(Chitosan)是自然界广泛存在的甲壳素(Chitin)经脱乙酰化得到的产物, 又名甲壳胺、聚氨葡糖、脱乙酰壳多糖等, 是天然多糖中唯一的碱性多糖, 具有许多独特的物理、化学特性和生物功能, 在食品、医疗、生物技术和药学等多个领域中应用十分广泛。小于20个单糖的壳聚糖称为低聚壳聚糖。有研究表明低聚壳聚糖具有抗辐射损伤的作用^{[1, 2]}, 并且壳聚糖毒性极低、来源丰富。笔者探讨了低聚壳聚糖辐射损伤防护效果及机理, 为用于筛选高效、低毒的辐射防护药物提供科学依据。

1 材料与试剂 1.1 低聚壳聚糖

本实验研究的低聚壳聚糖以食品级大分子壳聚糖为原料, 敏化剂协同作用, 经辐照降解氧化后制备而成。分子量 < 2 kD, 分散系数1.21。灌胃前用蒸馏水配制成溶液。

1.2 实验动物

清洁级Balb/c小鼠, 体重18~22g, 军事医学科学院动物中心生产, 生产许可证:SCXK (军)2002-018。中国辐射防护研究院GLP中心动物实验室饲养管理。

1.3 辐射源

⁶⁰Coγ源, 活度1.223×10¹⁵Bq (33 047Ci), 中国计量科学院刻度。

1.4 仪器

B600型低速离心机, 国产; 显微镜, OLYPUSE; BS124S电子天平:北京赛多利斯。

2 实验方法 2.1 30d存活率试验 2.1.1 给药方法和照射条件

实验小鼠随机分为单纯照射组、给药组(60mg/kg), 每组15只。给药组连续灌服低聚壳聚糖14d, 每天1次, 其中第7天各组动物进行⁶⁰Coγ射线全身照射, 照射剂量为6Gy, 剂量率0.5Gy/min。单纯照射组灌服蒸馏水。

2.1.2 观察指标

观察不同处理组30d的小鼠存活情况, 包括30d存活率、平均存活天数、保护指数。

式中, a、a'分别为给药组与对照组的小鼠平均存活天数; b、b'分别为给药组与对照组的小鼠死亡数; c、c'分别为给药组与对照组小鼠的30d存活只数; n、n'分别为给药组与对照组小鼠总数。

2.2 小鼠造血系统辐射损伤防护试验 2.2.1 给药方法

实验小鼠随机分为正常对照组、单纯照射组、低剂量给药组(60mg/kg)、中剂量给药组(120mg/kg)、高剂量给药组(240mg/kg), 每组10只。各给药组分别连续灌服低聚壳聚糖14 d, 每天1次。正常对照组和单纯照射组灌服蒸馏水。第7天除正常对照组外其余组小鼠均接受⁶⁰Coγ射线全身照射。

2.2.2 观察指标和照射条件 2.2.2.1 骨髓有核细胞数

取小鼠股骨, 用1 mL白细胞稀释液冲出骨髓液, 白细胞稀释液调整细胞浓度, 用细胞计数板在显微镜下计数骨髓有核细胞数。

2.2.2.2 骨髓有丝分裂指数(mitoticindex, MI)

照射后第14天进行如下实验, 步骤如下:①处死动物前6h, 腹腔注射秋水仙素9mg/kg。颈椎脱位法处死动物, 迅速取出股骨, 去肌肉, 擦净血污, 剪开两端关节面, 用注射器吸3.8%柠檬酸钠5mL冲出骨髓与离心管中, 用1 500r/min离心10min, 去上清液; ②低渗:打散沉淀物, 加入预热37℃的0.075mol/LKCl约6mL, 混匀, 于37℃低渗20min, 再加固定液2mL, 立即1 000r/min离心10min, 去上清液; ③固定:使细胞悬浮, 加入固定液4mL, 放置室温20min, 然后1 000r/min离心10min, 去上清液, 留0.5mL; ④制片染色将细胞悬液滴于冰冻的载玻片上, 干燥, 用10% Giemesa染色液染色15min, 清洗后, 自然干燥。⑤显微镜下观察。

有丝分裂指数(‰)=有丝分裂中期的细胞个数/观察细胞总数

照射条件:骨髓有核细胞数和骨髓有丝分裂指数实验照射剂量为3.5Gy, 剂量率0.5Gy/min。

2.2.2.3 内源性脾结节法(colony-formingunit-spleen, CFU -S测定)

照射后第9天脱颈椎法处死小鼠, 取脾, 放入Bouins液中固定12h后, 用放大镜观察脾表面的脾结节, 计数。

2.2.2.4 脾指数测定

小鼠称重, 脱颈处死后取脾, 电子天平称重, 求其脏器指数。照射条件:内源性脾结节法和脾指数测定实验照射剂量为6.5Gy, 剂量率0.5Gy/min。

2.3 统计方法

用χ²检验对30d存活率差别的显著性进行检验, 用t检验对两样本均数差别的显著性进行检验。

3 结果与讨论 3.1 小鼠30 d存活率试验

表 1列出了低聚壳聚糖对受照小鼠30d存活情况的影响。结果可见, 给药组的存活率比单纯照射组提高20%, 平均生存天数有显著提高(P < 0.05), 保护指数达到1.36(保护指数≥ 1.2为有效)。可见给予低聚壳聚糖能够明显保护受照小鼠, 减轻辐射损伤。

3.2 小鼠造血系统辐射损伤防护试验

单纯照射组、低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组经过⁶⁰Coγ射线全身照射和/或灌服低聚壳聚糖处理后, 观察低聚壳聚糖对受照小鼠骨髓有核细胞数、MI和CFU-S等的影响。结果分别列于表 2、表 3。

由表 2可见, 单纯照射组照射后第14天小鼠骨髓有核细胞数明显下降, 未见恢复, 而低聚壳聚糖低、中、高剂量给药组有核细胞数均高于单纯照射组, 并随给药剂量的增大而升高, 并且中、高剂量给药组有核细胞数均显著高于单纯照射组(P < 0.05, P < 0.01)。表明给予低聚壳聚糖能够减轻受照小鼠骨髓有核细胞辐射损伤。另外, 有丝分裂指数结果表明, 照射后14d动物的有丝分裂指数明显降低, 且未见恢复, 而低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组有丝分裂指数均高于单纯照射组, 并随着给药剂量的增大而升高, 其中中剂量给药组、高剂量给药组差异具有统计学意义(P < 0.01, P < 0.05), 低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组有丝分裂指数分别恢复到正常对照组的13.4%、26.4%、51.1%。

辐射损伤是以引起造血组织损伤为主, 伴有其他系统改变的放射性疾病。骨髓对辐射具有高敏感性^[3], 骨髓中含有丰富的造血干细胞、祖细胞和各系统不同分化阶段的幼稚细胞, 是造血的主要器官, 其主要功能是通过造血干细胞增殖、分化形成多种成熟细胞, 并维持其恒定数量, 以执行造血系统的多种生理功能。另外, 细胞受到照射后, 诱发有丝分裂需要的蛋白质合成受到抑制, 造成G₂期阻断, 导致有丝分裂数量下降^[4]。此次实验动物受到照射后, 骨髓有核细胞数降低、有丝分裂指数下降, 但给药后, 二者均有提高, 结果表明, 低聚壳聚糖对照射后受损的辐射敏感器官骨髓具有明显的保护作用。

动物受到6.5 Gy照射后, 单纯照射组脾重、脾脏系数均与正常对照组有明显的差别, 而给药组各组脾重、脾脏系数、CFU -S数均较单纯照射组高, 且随着给药剂量的增大而增高, 有明显的上升趋势。其中低剂量给药组脾重、脾脏系数与单纯照射组差异有统计学意义(P < 0.05), 高剂量给药组脾结节数与单纯照射组差异均有统计学意义(P < 0.05)。

造血组织对辐射非常敏感, 造血干细胞是辐射攻击的主要靶细胞。其经典测试方法脾结节技术, 通过对脾结节的研究来推知造血干细胞的性能。每一个脾结节成为一个脾结节生成单位。研究者认为:造血干细胞的测定是筛选有效辐射防护剂的简便方法, 而内源性脾结节测定方法是筛选有效抗辐射药物的较好指标^[5]。本实验中动物受到6.5Gy照射后, 给药后造血干细胞在一定程度上得到恢复, 表明该药物对造血干细胞有保护作用。

4 结语

给小鼠灌服低聚壳聚糖, 可以提高30d存活率, 提高平均生存天数, 能减轻受照小鼠骨髓有核细胞辐射损伤、保护有丝分裂所需蛋白质合成、促进造血干细胞的恢复。故低聚壳聚糖对受照小鼠造血系统起到一定的保护作用, 从而减轻辐射对机体的损伤, 达到辐射损伤防护的效果。