硒是人和动物必需的微量元素, 具有抗氧化、抗肿瘤和延缓衰老等功能。但是, 传统硒源使用的最佳浓度和致毒浓度之间的安全限度非常狭窄。纳米硒是纳米级的单质硒, 与单质硒的物理和化学性质有很大不同:如由黑色变为红色; 由不溶于水变为透明胶体溶液等。小鼠急性毒性和慢性毒性实验表明, 纳米砸毒性远低于亚砸酸钠(纳米砸LD50=112.98mg/kg· BW, 亚砸酸钠LD50=15.72mg/kg·BW)[1-3]。本试验我们以小鼠为试验对象, 进一步观察纳米砸对免疫调节及辐射防护方面的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 纳米硒由烟台某药业公司提供。
1.1.2 实验动物SPF级昆明种小白鼠, 雌性, 体重18~22g, 由中国医学科学院实验动物研究所提供, 实验动物生产许可证号:SCXK-(京)2005-0013。伺养环境为屏障级动物室, 实验动物使用许可证号:SCXK-(鲁)20080005。
1.1.3 主要仪器与试剂洁净工作台、二氧化碳培养箱、Spectramax PLUS型酶标仪(美国)、显微镜、电子数显卡尺(精密度0.01mm)等; YAC-1细胞、绵羊红细胞(SRBC)、鸡红细胞、Tris-HCI缓冲液、1% NP40、刀豆蛋白A(ConA)、MTT、补体(豚鼠血清)、都氏试剂、SA缓冲液、印度墨汁、RPMI1640细胞培养液、Hank's液、PBS缓冲液、琼脂糖、LDH基质液、Giemsa染液等; SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2 方法[4] 1.2.1 剂量选择与动物分组取160只雌性小鼠按体重随机分为4个大组, 每个大组40只, 内设3个剂量组(含砸2.5μg/kg·BW、5.0μg/kg·BW、15.0μg/kg·BW)和1个空白对照组。经口灌胃给予纳米砸, 每日1次, 连续30 d, 空白对照组则给予同体积的蒸馏水。末次给药后对小鼠进行免疫功能测定。检测指标包括:迟发型变态反应(DTH); CoA诱导的脾淋巴细胞增殖能力; 单核巨噬细胞碳廓清指数及对鸡红细胞吞噬指数; 抗体生成细胞数; 血清溶血素。另取120只雌性小鼠按体重随机分为3个大组, 每个大组40只, 内设3个剂量组和]个辐射模型对照组。剂量设计及给药方式同上, 进行抗辐射指标检测, 包括外周血白细胞计数实验、小鼠骨髓细胞DNA含量实验、血中超氧化物歧化酶(SOD)活性实验。
1.2.2 迟发性变态反应(DTH)小鼠用2%(V/V)绵羊红细胞(SRBC)腹腔免疫, 4天后, 测量左后足跖的厚度, 然后在测量部位皮下注射20%(V/V)SRBC, 注射后于24h测量左后足跖的厚度, 同一部位测量3次, 取平均值。
1.2.3 小鼠脾淋巴细胞转化测定将小鼠脾脏制成3 ×106个/ml细胞悬液, 分两孔加人24孔培养板中, 一孔加50μl ConA液, 另一孔作对照, 在5% CO2和37℃环境下培养72h。培养结束前4h, 每孔吸去上清液0.7ml, 加人0.7ml RPMI1640培养液, 同时加人MTT50μL/孔, 继续培养4h, 每孔加人1ml酸性异丙醇, 使紫色结晶完全溶解后, 在570mn处测定光密度值(OD)。
1.2.4 血清溶血素(半数溶血值HC50)测定用脱纤维SRBC免疫5d后, 取血清用SA缓冲液稀释(1:200)。将稀释后的血清1mL置试管内, 依次加人10%(V/V)SRBC 0.5mL, 补体1mL(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后, 离心取上清液1mL, 加都氏试剂3mL, 同时取10%(V/V)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL, 充分混匀, 放置10min后, 于540nm处测定光密度值, 计算半数溶血值(HC50)。
1.2.5 抗体生成细胞检测SRBC免疫5d后, 将脾脏细胞悬液。将表层培养基加热溶解后, 与等量pH7.2的Hanks液混合, 分装小试管, 再向管内加人50μl 10% SRBC、20μl脾细胞悬液, 涂于已刷琼脂薄层的玻片上, 在CO2培养箱温育1.5h, 然后用SA缓冲液稀释的补体(1:10)加人到玻片架凹槽内, 继续温育1.5h后, 计数溶血空斑数。
1.2.6 小鼠碳廓清指数测定动物连续给样30d后, 于尾静脉注射1:3稀释的印度墨汁, 立即计时。分别于注入墨汁后2min、10min, 从眼内眺静脉采血20μL, 加到2ml Na2CO3溶液中, 在600mn波长处测光密度值(OD)。将动物处死, 取肝脏和脾脏称重, 计算廓清指数。
1.2.7 巨噬细胞吞噬能力每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 ml, 30min后, 将小鼠颈椎脱日处死, 固定于鼠板上, 注射生理盐水2ml, 转动鼠板1 min, 吸出腹腔洗液1ml, 分滴于2片玻片, 于37℃温育30min, 用生理盐水漂洗, 晾干, 以1:1丙酮甲醇溶液固定, 4% Giemsa-磷酸缓冲液染色3min, 漂洗晾干镜检, 计算吞噬指数。
1.2.8 外周血白细胞计数实验小鼠取尾血计数白细胞总数, 并依此为指标随机分为辐射模型对照组和三个剂量组, 在实验的第30天各组均以4Gy60Coγ射线照射一次, 照射后第3、14天作白细胞计数。
1.2.9 小鼠骨髄细胞DNA含量实验剂量组与辐射模型对照组小鼠均以4Gy60Coγ射线照射一次, 照射后第3天处死小鼠, 取股骨, 用注射器(6.5号针头)吸取6ml Hank's液, 冲出股骨中的全部骨髄细胞, 在260nm处测定光密度值(OD)。
1.2.10 血清超氧化物歧化酶(SOD)活性实验剂量组与辐射模型对照组均以6Gy60Coγ射线全身照射一次。于照射后第7天, 摘眼球采血, 离心, 取血清, 按试剂盒说明书测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活力。
1.2.11 统计分析采用SPSSll.0软件对数据进行统计分析。
2 结果 2.1 纳米硒对小鼠细胞免疫的影响5.0μg/kg、15.0μg/kg纳米砸组DTH增加值与对照组比较差异有统计学意义(t=4.37, P < 0.05;t=5.19, P < 0.05), 表明纳米硒对小鼠迟发型变态反应能力有促进作用; 5.0μg/kg、15.0μg/kg纳米砸组ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力明显增高与对照组比较差异有统计学意义(t=5.13, P < 0.05;t=5.70, P < 0.05)。表明纳米砸可增强小鼠细胞免疫功能。结果见表 1。
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表 1 纳米硒对小鼠淋巴细胞增殖及转化的影响(x±s) |
15.0μg/kg纳米砸组溶血空斑数和半数溶血值与对照组比较都差异有统计学意义(t=4.42, P < 0.05;t=4.62, P < 0.05)表明纳米砸可增强小鼠体液免疫功能, 结果见表 2。
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表 2 纳米硒对小鼠抗体及溶血素的影响(x±s) |
5.0μg/kg、15.0μg/kg纳米砸组廓清指数与对照组比较差异有统计学意义(t=3.28, P < 0.05;t=4.99, P < 0.05);5.0μg/kg、15.0μg/kg纳米砸组吞噬指数与对照组比较差异有统计学意义(t=4.20, P < 0.05;t=5.81, P < 0.05)。表明纳米砸可增强单核巨噬细胞的功能, 结果见表 3。
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表 3 纳米场对小鼠单核巨嗔细胞功能的影响(x±s) |
照射后第3天辐射模型对照组的白细胞计数与照射前比较, 差异有统计学意义(P < 0.01), 说明辐射损伤模型成立。照射后第3d 5.0μg/kg、15.0μg/kg纳米砸组白细胞计数与辐射模型对照组比较差异有统计学意义(t=3.53, P < 0.05;t=5.18, P < 0.05);照射后第14天5.0μg/kg、15.0μg/kg纳米砸组白细胞计数与辐射模型对照组比较差异有统计学意义(t=3.56, P < 0.05;t=5.17, P < 0.05)。结果见表 4。
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表 4 纳米硒对小鼠单核巨噬细胞活性的影响(x±s) |
5.0μg/kg、15.0μg/kg纳米硒组骨髄细胞DNA含量与辐射模型对照组比较差异有统计学意义(t=4.25, P < 0.05;t=6.31P < 0.05);15.0μg/kg纳米砸组SOD活性与辐射模型对照组比较差异有统计学意义(t=4.89, P < 0.05)。结果见表 5。
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表 5 纳米硒对小鼠骨髄细胞DNA含量和血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响(x±s) |
辐射作用于机体后, 出现形态变化最早的是造血、血液系统。造血系统辐射损伤后, 造血功能低下或衰竭, 白细胞、红细胞和血小板数明显减少, 从而诱发感染、贫血、出血等并发症。机体免疫系统是辐射损伤的敏感系统, 其中T淋巴细胞敏感性最高。机体由于辐射损伤产生免疫功能紊乱状态, 表现为免疫活性细胞数量减少, 抗体形成抑制或紊乱, 细胞因子网络调节失常。辐射还可通过激发体内产生自由基, 引起脂质过氧化, 造成对细胞、酶类及核酸等生物大分子的损害[5]。本实验结果表明, 纳米硒能显著增强小鼠的细胞免疫和体液免疫功能以及单核巨噬细胞吞噬功能。外周血白细胞总数、骨髓细胞DNA含量、血中超氧化物歧化酶(SOD)活性等都是反映辐射对机体损伤的敏感指标, 本实验中用一定剂量γ射线给小鼠全身照射一次后, 辐射模型对照组小鼠外周血白细胞计数、骨髓细胞DNA含量、SOD活力显著降低, 而受试物组小鼠的上述指标明显高于辐射模型对照组, 说明纳米硒有一定的抗辐射损伤作用。
近几年来研究的天然抗辐射损伤活性成分主要有:多糖类通过增强机体免疫功能加大了清除自由基的能力, 有效地减轻了辐射对机体的损伤; 生物碱类通过防止碱基损伤和减少DNA链的断裂达到有效的辐射保护; 酚类物质的多元酚羟基具有与氧自由基反应的作用, 截断自由基的链式反应, 从而具有良好的捕集自由基等抗辐射功效; 皂甙类辐射防护作用与其抗脂质过氧化作用密切相关; 香豆素类可以抑制磷酸二酯酶, 使细胞内cAMP浓度增加, 从而产生辐射防护作用[6]。而砸在机体的生物学功能主要是通过砸蛋白来实现的, 含硒的GSH-Px属于抗氧化酶, 可有效地去除H2O2、脂类和磷脂过氧化物, 从而维护膜的完整性, 同时调控花生四烯酸的合成、控制机体炎症反应及氧化损伤。脱碘酶是甲状腺激素代谢的关键酶, 砸是脱碘酶活性中心, 对脱碘酶的表达和活力具有重要作用, 硒在甲状腺素的合成、活化、代谢过程中及甲状腺抗氧化系统和免疫系统中发挥着重要作用[7]。本次研究实验中6项免疫指标和抗氧化酶SOD活力的显著增强也提示:纳米砸可能通过增强机体的免疫力和抗氧化能力而达到其辐射防护作用。
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