, 脑胶质瘤是中枢神经系统常见的原发肿瘤, 约占成人颅内肿瘤的30%~50%, 且恶性胶质瘤生存期短, 死亡率高, 治疗困难。目前, 放疗仍是治疗脑胶质瘤的重要手段之一, 但临床上放疗效果欠佳, 其一受到放射剂量的限制, 再者就是大多数脑胶质瘤细胞对射线的敏感性差, 加大照射剂量又会增加周围正常脑组织的辐射损伤, 因此, 研究脑胶质瘤细胞的辐射敏感性显得十分重要。TAM是临床上用于治疗乳腺癌的一种非类固醇类抗雌激素药物, 笔者主要探讨TAM是否抑制人体外周血淋巴细胞对PHA和LPS的反应, 以及TAM能否作为放射增敏药物提高脑胶质瘤细胞的辐射敏感性。
1 材料与方法 1.1 材料TAM (分子量371.5)购自sigma公司, 3H-TdR购自上海原子核所, 人脑胶质瘤细胞SHG-44由苏州大学附属第一人民医院脑研室提供, 60Co辐射源由本院辐照中心提供, 瑞典法码西亚公司Wallac1409型液体闪烁计数仪。瑞士Inotech公司UM100型多功能细胞收集器。
1.2 方法 1.2.1 3H-TdR掺入法检测脑胶质瘤细胞DNA合成将细胞接种在含10%小牛血清的RPMI1640培养液中, 置37℃, 含5% CO2的培养箱中培养。实验时取对数生长期细胞, 常规消化制备成单细胞悬液, 调节细胞浓度为2 ×104/ml, 分别接受0、1、2、3、5、7、9Gy的60Coγ射线照射, 剂量率1Gy/min。接种于24孔板, 每孔加1ml细胞悬液。分为单独照射组、照射+TAM处理组(TAM终浓度为15μmol/L, 我们在以前的实验中得出此浓度为TAM的半数有效浓度IC50)。第2天每孔加入3HTdR10μl (2.4 ×104Bq), 72h后消化细胞, 将细胞收集到49型玻璃纤维滤膜上, 烘干滤膜片, 在液体闪烁计数器上测量每个样品的每分钟计数(cpm)值。细胞存活分数=实验组cpm值×100%/对照组cpm值。以存活分数的对数对照射剂量作图, 描绘剂量-效应曲线。
1.2.2 SHG-44细胞辐射敏感性的剂量-效应曲线参数分析采用多击或多靶方程S=ne-KD分析放射剂量-效应曲线的有关参数。S指存活分数, D为照射剂量, D0是量效曲线上直线部分S每下降63%所需的剂量, n代表直线部分外延至Y轴的截距(称外推值), e为自然为底的对数。以上参数的计算方法见文献[1, 2]。
1.2.3 TAM对人体外周血淋巴细胞转化的影响抽取健康成人血10ml, 肝素抗凝处理。将细胞分为PHA组(每100ml细胞培养液含50mgPHA)、LPS组(每100ml细胞培养液含2.5 mgLPS)、不加PHA和LPS组, 每组按TAM的终浓度再分为0、2、4、6、8μmol/L组。实验时各组取培养液2ml, 加全血0.1ml, 培养56h后加3H-TdR2.4 ×104 Bq, 继续培养16h, 收获细胞, 测量每个样品的cpm值。
1.2.4 统计学处理实验结果采用SPSS统计软件检验分析, 数据以x±s表示, 组间比较采用t检验。
2 结果 2.1 TAM对脑胶质瘤细胞辐射敏感性的影响从图 1可见, 细胞的存活分数随着照射剂量的增高而下降, SHG-44细胞的剂量效应曲线表现为低剂量区的"肩区"和高剂量区的直线部分。我们对单独照射时SHG-44细胞的剂量-存活曲线高剂量区的部分进行直线回归方程拟合, 得lny=5.0669-0.3037x (y代表存活分数, x代表照射剂量), r=-0.9974, P<0.01。求得直线部分外延至Y轴的截距即靶的数目n=1.59, D0= 3.27Gy。加入15μmol/L的TAM后使脑胶质瘤细胞的剂量-效应曲线发生左移, D0值降低, 且存活曲线不再有"肩区", 直线回归方程拟合为lny=4.3082-1.2221x, r=-0.9806, P<0.05。求得D0=0.57 Gy, 和单独照射时的D0值比较差异有统计学意义(P<0.01)。
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图 1 TAM对脑胶质瘤细胞辐射敏感性的影响 |
PHA可刺激T细胞分裂, LPS可刺激B细胞分裂。从表 1可见, 实验浓度的TAM不影响T细胞对PHA的反应(P>0.05), 从表 2可见, 虽然随着TAM浓度的升高, 细胞的3H-TdR掺入值略有下降趋势, 但和对照组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。从表 3可见, 在没有刺激原存在的情况下, 细胞的3H-TdR掺入值随着TAM浓度的增高而下降, 但和对照组比较差异并无统计学意义(P>0.05)。
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表 1 TAM对T细胞转化的影响 |
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表 2 TAM对B细胞转化的影响 |
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表 3 无外界刺激原时TAM对外周血细胞增殖的影响 |
脑胶质瘤细胞SHG-44的存活分数随照射剂量的增高呈指数性降低, 其剂量-存活曲线分两部分, 表现为低剂量区(< 2 Gy)的"肩区"和高剂量区的直线部分, 属于多击多靶模型。细胞的靶区必须被击中多次或多个靶区各被击中一次, 才会引起细胞的损伤效应; "肩区"说明SHG-44细胞有修复亚致死损伤的能力, 使得SHG-44细胞具有一定的辐射抗性, 与其他文献报道一致[3]。实验得出, TAM联合照射使脑胶质瘤细胞SHG-44剂量-存活曲线的形状发生了改变, 该曲线无"肩区", 即在联合作用下, SHG-44细胞失去了亚致死性损伤修复的能力, 辐射敏感性增加。TAM使SHG-44细胞的存活曲线由多击多靶模型变成了单击单靶模型, 细胞的平均致死剂量D0值由原来的3.27Gy下降至0.57Gy (P<0.05), 可见TAM显著提高了脑胶质瘤细胞SHG-44对60Coγ射线的辐射敏感性。
TAM作为一种非类固醇类抗雌激素药物, 自1969年英国首先作为治疗药物用于临床以来, 此后, 世界上有近百个国家已将之成熟地应用于治疗雌激素依赖性乳腺癌和卵巢癌等。近年来国外对TAM的临床和实验研究发展很快, 发现TAM的主要代谢产物去甲TAM, 能使一些药物的多药抗药性(MDR)表现型逆转, 使药物血浆浓度可达到抑制P-糖蛋白在抗癌药中的作用, 提高抗癌药在癌细胞的浓度, 即增敏效应。Puchner[4]认为当TAM在血浆中的浓度达到4~6μmol/L时, 能使细胞内抗癌药物浓度提高, 并对多种人和鼠类癌细胞的杀伤力增强3~ 4倍。另有报道TAM能透过血脑屏障[5], 且对人体毒副作用小[6], 我们在实验中也证实, 2~8μmol/L的TAM对人体外周血淋巴细胞对PHA和LPS的反应无抑制作用, 在不存在外界刺激原时, TAM对人体外周血细胞的增殖也无抑制作用, 以上说明该浓度范围内TAM对人体外周血免疫细胞几乎没有杀伤作用, 毒性较小。放射治疗的最终效果与机体的免疫功能有密切的关系, 在体外TAM能提高脑胶质瘤细胞对γ线的辐射敏感性, 同时对人体外周血免疫细胞无杀伤作用, 因此, 将TAM作为一种辐射增敏药物用于脑胶质瘤的放射治疗具有一定的可行性.
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