微波技术发展日新月异, 其在通讯、公路交通、医药卫生、航空航天及环境保护等方面的应用日益广泛, 但随之而来的环境污染及辐射引起的人类健康问题亦越来越受到人们重视。研究表明, 神经系统是微波辐射的高敏感靶部位之一^{[1, 2]}, 研究高功率微波(hign power microwave, HPM)辐射对下丘脑-垂体神经内分泌网络功能的影响以及热休克蛋白(Hsp)在辐射损伤修复中的作用, 对于阐明微波损伤效应、作用机制以及制订我国HPM辐射安全防护标准具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组

二级成年雄性Wistar大鼠54只(长春高新医学动物实验研究中心提供), 雌雄各半, 体重(200 ± 20) g, 随机分为对照组(18只)和实验组(36只)。实验组又分为100mW/cm²组(18只)和200mW/cm²组(18只)。各组大鼠同一种饲料平行饲养, 适应性喂养一周后, 进行动物实验。

1.2 辐照方法

微波辐射源为大功率雷达发射机改装的微波发射机, 峰值功率2MW, 出口由渐变型波导制成的矩形喇叭辐射到被照物体, 照射参考点为大鼠背部体表^[3]。照射功率密度为100mW/cm²和200mW/cm², 照射时间5min。照射时, 环境温度为(20 ± 0.5)℃, 相对湿度40%。

1.3 大鼠β-Ep、ACTH含量测定

辐射后, 各组大鼠分6、24和48h时间点处理。20%乌拉坦麻醉, 腹主动脉抽血, 肝素抗凝, 离心分离血浆。冰浴下取脑, 分离垂体, 置生理盐水中煮沸5min。加1mol/LHCl匀浆后, 用1mol/LNaOH中和。离心分离上清, -20℃保存待测。脑垂体和血浆β -内啡肽(β - Ep)、促肾上腺皮质激素(ACTH)含量测定由第二军医大学神经生物学教研室协助测定。

1.4 Hsp70检测方法

取20μl血浆, 采用Western blot法检测血浆中Hsp70含量, 第一抗体为免抗人Hsp70(华中科技大学同济医学院─加拿大Tanguay教授惠赠), 第二抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司), 图像分析仪(日本岛津双波段色谱扫描仪CS-930)扫描, 用积分扫描面积表示Hsp70含量。

1.5 统计学方法

应用SPSS 10.0统计学分析软件进行各组间相应资料的方差分析和t检验, 取P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 大鼠垂体β-Ep含量的测定

实验组照射后6h, β-Ep含量明显低于对照组(P < 0.01);100mW/cm²组辐射后24, β-Ep含量回升, 与6h组比较差异有显著性(P < 0.05); 200mW/cm²组辐射后24h, β-Ep含量仍明显低于对照组(P < 0.05), 48h组略有回升, 见表 1。

2.2 大鼠血浆β-Ep、ACTH含量的测定

实验组照射后6h, β-Ep和ACTH含量明显高于对照组(P < 0.05或P < 0.01), 24h后, β-Ep含量恢复正常; ACTH含量于48h后接近正常水平。见表 1。

2.3 大鼠血浆Hsp70含量的测定

微波辐射后Hsp70表达增加, 其中, 100mW/cm²辐射后6和24h组, Hsp70表达明显增加, 与对照组比较差异有显著性(P < 0.05), 48h恢复正常; 200mW/cm²组辐射后24h Hsp70表达明显增加, 与对照组比较差异有显著性(P < 0.05), 48h恢复正常。见表 2。

3 讨论

下丘脑-垂体是微波辐射的高敏感靶部位之一, 两者是神经内分泌调节途径的中心部位。下丘脑通过调控垂体激素的释放, 整合机体的功能活动。一般认为, 一定强度的微波辐射可引起脑组织结构与功能改变, 神经元变性、坏死^{[4, 5]}, 但引起损害的辐射阈强度仍未确定, 微波辐射损伤作用机制至今尚未明确。因此, 研究微波辐射对下丘脑-垂体功能的影响对于明确其损伤效应及作用机制具有重要意义。

POMC衍生肽主要包括β-Ep和ACTH, β-Ep是POMC分子中惟一包含的阿片肽序列, 正常情况下, 主要分布于下丘脑、垂体等处, 已知的阿片受体均为G蛋白偶联受体, 可降低细胞内cAMP水平, 抑制中枢神经系统的功能活动, 因此, 在调节感觉(主要是痛觉)、运动、内分泌、体温以及在缓解机体应激反应中都起着重要的调节作用^[6]。本研究显示辐照早期(6h)垂体β-Ep含量明显减少, 血浆β-Ep明显增高; 辐射强度为100mW/cm²时, 血β-Ep含量升高48%;200mW/cm²时, 升高32%, 而垂体β-Ep含量降低44%, 说明HPM辐射后大鼠血浆前阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin, POMC)衍生肽含量升高系下丘脑-垂体向血中释放所致。HPM辐射使血浆ACTH含量显著升高, 其中辐射后24h, 100mW/cm²组升高253%, 200mW/cm²组升高283%;48h后ACTH含量接近正常水平。血浆ACTH含量改变是由于垂体β-Ep通过下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的作用引起ACTH分泌增加。小剂量β-EP可使体温调节水平上升, 过量表达则抑制体温调节并能够损害学习和记忆功能^[7], ACTH有明显的抗热作用^[8]。本项研究表明, HPM辐射使垂体合成的β-Ep大量释放入血, 但因合成速度可能未能同时提高至相应水平, 致使辐射早期垂体β-Ep含量下降, 血浆中β-Ep含量急剧增加。而100mW/cm²组辐射后24h和48h, 随着损伤的不断修复, 垂体β-Ep表达和储备的增加, β-Ep含量逐渐恢复到正常水平。200mW/cm²组由于损伤较重, 24h和48h垂体合成β-Ep能力仍难以恢复, 致使垂体和血浆β-Ep含量仍然较低。

Hsp70是一类应激反应性蛋白质, Hsp家族包括Hsp70、Hsp40和GrpE蛋白质等。Hsp家族参与体内功能蛋白质的形成、变性蛋白质的修复以及损伤蛋白质的降解清除等, Hsp可保护细胞免受热损害。Piper^[9]等研究发现, 大鼠在43℃环境受热0.5h, 移至37℃后6h~ 8h热耐受已经形成, 且Hsp已被诱导产生, 合成达到高峰, 同时细胞也获得了最强的耐受力, 这显示了Hsp参与热耐受的形成与维持。本项实验发现, 100mW/cm²组辐射后6h-24h, Hsp70表达增加, 因200mW/cm²组辐射损伤较重, Hsp70延迟表达, 辐射后24h, Hsp70表达增加。Hsp表达增加使大鼠在受到亚致死温度时对热损害产生了抵抗能力。

综上所述, 大鼠对HPM辐射产生的热应激刺激的耐受能力是通过下丘脑-垂体神经内分泌网络的功能活动以及Hsp的表达进行调节, 说明β-Ep和ACTH参与了热应激大鼠损伤与修复的病理生理过程。