鼻咽癌在我国有很高的发病率, 其首选治疗方法是放射治疗。在鼻咽部接受放疗的同时, 不可避免的要照射到鼻腔正常组织, 对其造成一定的损伤。临床上表现为鼻塞、流涕、咽部干燥感等症状, 这些症状在放疗后很长一段时间不能消失。大量研究表明, 组织的损伤程度与辐射剂量有一定的关系, 但鼻黏膜的损伤程度与辐射剂量的关系目前尚不清。

有研究表明, 辐射对鼻黏膜的损伤主要为损伤性炎症反应的后果^[1]。IL-1、IL-6、TNF-α是启动炎症反应的重要细胞因子, IL-1能刺激吞噬细胞和内皮细胞分泌趋化因子, 刺激血管内皮细胞表达白细胞粘附分子; IL-6可直接作用于血管内皮细胞, 使其通透性增加, 导致大量炎性渗出; TNF-α能激活炎性白细胞杀灭微生物, 并通过刺激血管上皮细胞表达粘附分子, 引起白细胞在炎症部位的聚集。为此本研究拟观察不同剂量的辐射对鼻黏膜结构的损伤, 并探讨辐射性损伤与致炎细胞因子的关系。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康实验豚鼠共125只, 体重(350 ±10) g, 鼠龄6~8周, 雌雄不限, 由南昌大学医学院实验动物中心提供。实验动物置于超净的动物柜内, 饲以消毒的专用豚鼠饲料和水。

1.2 实验分组

实验豚鼠随机分为五个大组, 每组25只。A组为正常对照组, 仅进行假照射。B、C、D、E组为照射组, 每周照射一次, 剂量分别为3Gy、5Gy、7Gy、10Gy, 连续照射三周。

1.3 照射条件及方法

氯氨酮注射麻醉豚鼠, 以自制的豚鼠固定盒, 一次固定六只于盒中, 头部居中, 尾部朝外, 用WDVE-6型医用加速器产生的6MeV电子线(剂量率为180Gy/min), 选择实验豚鼠作仰卧位鼻部垂直局部照射, 照射野大小为4cm×5cm, 前达鼻腔前鼻孔, 后以双耳后连线为界。在10cm×10cm的限光筒特制的铅模中, 保护好周围组织, 照射野上方加一厚约1.5cm的蜡块, 以确保照射中心位于鼻黏膜表面。每周一次, 每次剂量分别为3Gy、5Gy、7Gy, 10Gy连续照射三周。对照组采用假照射。各组分别于照射完后1周及1、2、3、4月处死动物各5只。

1.4 观察指标

动物处死前穿刺取血5ml, 离心取血清低温保存待测, 严格按试剂盒说明检测血IL-1, IL-6和TNF-a的含量。动物处死后, 迅速暴露鼻黏膜, 观察并记录鼻腔黏膜的一般情况。取中鼻甲前端黏膜分成三部份, 一部分用生理盐水冲洗干净后放入10%甲醛溶液中固定, 常规石蜡包埋, 连续切片, HE染色, 光镜下观察。一部分用4℃生理盐水冲洗干净后, 立即放入4℃ 2.5%戊二醛溶液中固定, 分别严格按照常规方法制作成透射和扫描电镜标本。

1.5 数据统计分析方法

计量资料均以x±s表示, 应用SPSS12.0软件进行统计分析。多组资料比较用方差分析, 当总的比较差异有统计意义后, 各实验组与对照组比较用q检验法, P < 0.05为统计有意义。

2 结果 2.1 一般情况

照射前及A组假照射后豚鼠均活动自如, 食欲良好, 毛色光泽。B、C组豚鼠照射后食欲稍减退, 一周后渐恢复正常, 照射区有脱毛现象, 但无动物死亡。D、E组照射后食欲明显减退, 日渐消瘦, 照射区明显脱毛, 皮肤充血水肿。D组于照射后二个月内死亡3只, 死亡率为12%;三个月内死亡10只。E组二个月内死亡15只, 死亡率为60%。经方差分析P < 0.05, 表明辐射剂量越大死亡率越高。

2.2 鼻黏膜病理变化

照射前及A组豚鼠鼻黏膜光滑红润, 无充血、水肿。光镜下可见假复层柱状上皮, 由柱状细胞、杯状细胞和基底细胞组成, 固有层为结缔组织, 有丰富的腺体及血管和神经等组织, 未见明显炎性细胞浸润。透射电镜见柱状上皮细胞排列规则, 纤毛整齐, 纤毛横截面可见围绕在两中心微小管周围的九对外周微小管, 即“ 9 +2”结构。扫描电镜见黏膜上皮完整连续, 纤毛排列整齐, 粗细均匀, 长短一致, 覆盖整个鼻腔黏膜。B组:照射后1周见豚鼠鼻腔少量粘脓性分泌物, 鼻黏膜充血、水肿。光镜下黏膜上皮结构轻度变性、排列不规则, 黏膜下见少量中性粒细胞和其它炎性细胞浸润, 腺体增生, 分泌增强。电镜下上皮细胞胞膜尚完整, 胞核正常, 但胞浆轻度变形。扫描电镜下黏膜上皮未见明显脱落, 杯状细胞轻度增加, 纤毛少许减少, 但方向一致。1月时鼻黏膜病变稍加重, 部分上皮细胞坏死, 黏膜下炎性细胞增多。电镜下上皮细胞胞胞浆进一步变形, 可见大小不等空泡, 线粒体变形、结构不清。扫描电镜下黏膜上皮基本完整, 纤毛进一步减少, 但形态基本正常。2月时黏膜充血明显减轻, 黏膜上皮完整, 黏膜下无明显炎性细胞浸润。电镜下上皮细胞细胞膜完整, 部分胞质变形, 胞核完整, 有纤毛再生现象。扫描电镜见黏膜上皮完整, 纤毛形态基本正常。4月时光镜下黏膜上皮结构正常。电镜下细胞形态较正常, 排列较整齐, 有较多再生纤毛。扫描电镜下见黏膜完整, 纤毛结构基本正常。

C组:照射后1周时鼻腔内脓性分泌物充填, 鼻黏膜充血、水肿较明显。光镜下黏膜上皮变性, 排列不齐, 部分上皮细胞坏死, 黏膜下见较多中性粒细胞浸润, 血管和腺体增生, 杯状细细胞增多, 分泌增强。电镜下细胞连接间隙增宽, 部分上皮细胞缺失, 细胞膜部分溶解, 胞质变形, 部分区域纤毛消失。扫描电镜下见部分黏膜上皮脱落, 纤毛倒伏, 部分区域纤毛脱落。1月时, 鼻腔可见脓性分泌物增多, 黏膜充血、水肿加重。光镜下见黏膜上皮细胞成片状坏死脱落, 黏膜下层仍有中性粒细胞及较多的淋巴细胞浸润, 基底层尚完整, 纤维结缔组织增生, 血管仍扩张、充血, 腺体增生(图 1); 部分区域可见纤毛柱状上皮再生现象, 再生区域柱状细胞排列散乱, 细胞核位置高低不一, 细胞表面纤毛稀疏。透射电镜下见上皮内有许多大小不等的空泡, 线粒体变形、结构模糊不清或消失(图 2)。扫描电镜下见上皮表面结构模糊不清, 上皮脱落明显, 仅少部分区域还覆盖有纤毛结构, 残剩的纤毛排列不齐。2月鼻腔脓性分泌物减少, 但仍见鼻黏膜充血。光镜下部分区域黏膜上皮变性、坏死, 部分区域黏膜上皮再生修复, 再生上皮细胞较1月时整齐, 细胞表面可见微绒毛, 部分区域可见纤毛结构, 但纤毛长短不一, 排列不齐。黏膜下中性粒细胞减少, 仅有少量淋巴细胞浸润, 纤维结缔组织增生, 腺体萎缩。电镜下上皮细胞仍见变性, 排列不齐, 胞膜溶解, 胞质突出, 部分区域见再生纤毛。扫描电镜下纤毛脱落区表面可见再生纤毛, 但长短不一, 方向性较差。3月时鼻腔无明显脓性分泌物, 充血水肿明显减轻。光镜下黏膜上皮继续修复, 上皮细胞排列大多较整齐, 细胞表面纤毛有些生长良好, 排列整齐, 但有些区域仍以微绒毛居多, 部分区域出现鳞状上皮化生。黏膜下组织仍有轻度水肿及少量淋巴细胞, 血管周围纤维组织增生。电镜下见细胞连接尚紧密, 有再生纤毛, 胞浆内分泌颗粒减少。扫描电镜下见长柱形细胞排列较整齐, 细胞表面有明显纤毛, 并有一定方向性、长短不一, 有些为微绒毛, 部分区域鳞状上皮化生。4月时见鼻黏膜上皮修复大部分完成, 大多为化生的鳞状上皮覆盖, 固有层中不见中性粒细胞及其它炎性细胞, 杯状细胞散在、零星分布(图 3)。扫描电镜下少部分上皮细胞见排列较稀疏的纤毛, 但大部分已失去正常的纤毛柱状上皮结构特点, 为化生的鳞状上皮, 这部分上皮电镜下见细胞较大, 不规则, 呈多边形, 无纤毛结构(图 4)。

D组、E组:两组病理变化基本相似, 但E组较D组病变明显。照射后1周见鼻腔内大量脓性分泌物, 黏膜高度充血、水肿, 部分区域可见溃疡。光镜下黏膜上皮变性、排列不齐、或大片坏死脱落, 基底细胞也减少。黏膜下见大量炎性细胞浸润, 部分腺体不完整。电镜下大片上皮坏死、缺失, 残存上皮细胞连接疏松, 细胞内呈均质状, 细胞核崩解, 大部分区域纤毛消失。扫描电镜下黏膜上皮坏死脱落, 纤毛脱落或相互粘连、倒伏及断裂。1月时鼻腔仍可见脓性分泌物和鼻黏膜溃疡。光镜下黏膜上皮缺损较大, 残留上皮排列不齐, 黏膜下仍见大量炎性细胞浸润, 黏膜下层纤维结缔组织增生, 血管扩张, 腺体萎缩; 部分区域可见上皮再生, 修复的上皮排列紊乱。电镜下部分区域黏膜上皮细胞缺失, 残存黏膜上皮细胞结构模糊, 胞核崩解。扫描电镜下仍见多处黏膜上皮脱落, 纤毛融合或失去方向, 排列紊乱, 粗细不等, 相互粘连、倒伏及断裂。2月时鼻腔脓性分泌较以前减少, 鼻黏膜少许溃疡。光镜下见黏膜上皮修复现象, 但再生的上皮较C组排列更别紊乱, 主要为化生的鳞状上皮, 黏膜下仍有炎性细胞浸润。电镜下上皮细胞变形, 结构模糊, 胞质呈均质状, 部分区域见鳞状上皮化生。扫描电镜下黏膜仍见大片脱落, 脱落区夹杂少许残剩纤毛, 未见明显纤毛再生。

2.3 纤毛覆盖率

对各组实验豚鼠鼻黏膜扫描电镜照片进行纤毛覆盖面积定量分析, 各组纤毛覆盖面积情况见表 1。可见各实验组照射后1周时纤毛覆盖率最低, 1月后纤毛开始再生, 覆盖率有所增长; 同期内比较, 大剂量照射组纤毛覆盖率明显低于小剂量辐射组。

2.4 血清炎性细胞因子的表达 2.4.1 各组IL-1含量变化(表 2)

表 2显示, 辐射后各组IL-1含量明显升高, 并一直维持在较高水平, 和对照组比较有统计学意义(P < 0.05), 但不同剂量辐射组之间比较, 变化不明显。

2.4.2 各组IL-6含量(表 3)

从中可以发现, 当辐射剂量在15Gy以内时, 随着辐射剂量的增加, IL-6值明显升高, 并持续维持在高水平, 但组间比较无显著性意义。当辐射剂量大于15Gy时, IL-6的升高不明显或反而下降。

2.4.3 各组TNF-α检测含量(表 4)

从中可发现当辐射剂量在15Gy以内时, TNF-α在照射后一周时后轻度升高, 一个月达到高峰, 四个月仍未下降至正常, 但组间比较无显著性意义。当辐射剂量大于15Gy时, TNF-α未见明显升高。

3 讨论

在临床上, 许多鼻咽癌的病人在接受放射治疗期间及治疗后有鼻塞、流鼻涕、咽喉干涸、面部疼痛等症状, 分泌性中耳炎的发病率也明显上升, 这主要与放射线对鼻腔及咽喉部黏膜的损害有关。鼻咽癌患者放疗后病理检查发现鼻黏膜固有层中胶状纤维沉淀增加; 上皮细胞成层排列, 并且胞质逐渐减少; 超微结构发现纤毛减少, 胞内、胞间空泡形成, 纤毛异型, 大多这些病理变化甚至于在放疗后23a的病人中也可见到^[2]。放疗也会引起人粘液纤毛清除率下降^[3]。X射线照射对鼻粘液纤毛系统的结构和功能也有一系列的影响, 数周不能恢复。Ohashi^[4]观察到家兔鼻黏膜受X射线照射后杯状细胞分泌增强, 纤毛细胞内空泡形成, 核固缩, 纤毛运动减慢, 放射后2~3周纤毛细胞脱落和纤毛细胞的数量减少, 放射后第4周出现鳞状上皮化生, 第8周无纤毛运动。肖芒^[1]等研究也发现辐射损伤后早期主要表现为严重的急性炎症反应, 大量的炎性细胞渗出浸润、腺体增生。以后受损黏膜开始修复, 修复以再生的形式完成, 上皮细胞可能是由基底细胞分化、移行而来, 修复后的黏膜上皮大部分失去了正常纤毛柱状上皮结构, 而代之为化生的复层鳞状上皮, 上皮下层腺体组织明显减少。我们观察的结果进一步证实了这个结论。并且还发现大剂量照射比小剂量照射损伤严重, 修复时间要长, 当辐射剂量到一定量时产生不可复性损伤和动物死亡。

细胞因子是一组多肽类细胞调节物质的总称, 主要由外周的免疫细胞合成, 多为分子量较低的但又具有很高生物活性的分泌型蛋白, 通过与靶细胞表面的高亲合特异性受体结合而发挥作用。白细胞介素-1(interleukin-1IL-1)主要由单核细胞产生, 可作用于淋巴细胞、巨噬细胞和其它炎性细胞, 在细胞的激活、增殖和分化中起作用。同时还可促进B细胞增殖分化, 刺激骨髓多能干细胞增殖。白细胞介素-6(interleukin-6 IL-6)为分子量26 000的多肽, 是一种多来源并且有复杂生物学功能的细胞因子, 产生IL-6的细胞主要有单核-巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、角质细胞及T细胞等。IL-6功能复杂, 首先IL-6本身有强烈的致炎活性, 可直接作用于血管内皮细胞, 使其通透性增加, 导致大量的炎性渗出; 其次可促进B细胞增生分化和分泌抗体; 也可直接或间接增强自然杀伤细胞及细胞毒性淋巴细胞活性; 还可与TNF-α等协同, 构成炎症介质网络。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNFα)主要由单核巨噬细胞及激活的淋巴细胞产生, 是参与机体免疫反应和炎症反应的重要调节因子, 低水平的TNF-α在组织修复、炎症应答中起作用对机体有利; 但若产生过多, 或与其它细胞因子关系失调, 又会引起一系列炎性损害。此外TNF-α在炎症反应中, 是激活细胞因子级联反应的主要介质, 在循环中较早出现并迅速达到峰值, 尽管半衰期很短, 但足以诱发“次级”细胞因子如IL-1、IL-此6的产生, 由此激发炎症的联锁反应。Lennard等^[5]研究发现慢性鼻窦炎粘膜内有较高的促炎因子TNF-α、IL-1等的表达。李延忠等^[6]研究发现, 在慢性鼻窦炎鼻粘膜上皮可见TNF-α和IL-1的高表达, 并认为此二种细胞因子在慢性鼻窦炎的发病中起一定的作用。

辐射损伤与细胞因子的关系目前研究不多。林白桦等^[7]发现, TNF-α含量肺部照射后显著升高, 认为TNF-α有可能在放射性肺损伤早期的“放射性肺炎”中起致炎、致渗出作用。朱颖等^[8]研究发现, 全身辐射后, 小鼠伤口液中IL-1和TNF-α的含量增加。孙义敏等^[9]实验发现, 经不同剂量照射后, 小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达量升高, 以0.5Gy最高, 而4.0和6.0Gy照射后TNF-α表达则降低, 提示一定剂量电离辐射可诱导巨噬细胞产生TNF-α。我们研究发现, 对豚鼠鼻粘膜局部辐射也可导致机体IL-1、IL-6及TNF-α含量的变化, 当辐射剂量为15Gy以内时, 随着辐射剂量的增高, IL-1、IL6及TNF-α值逐渐升高倾向。且IL-1、IL-6及TNF-α含量在辐射后四个月内一直处于高水平, 提示辐射性损伤和细胞因子的高表达有密切的关系, 正是由于这些因子的持续高表达, 可引起组织剧烈及持续性的炎症反应, 导致组织损伤严重, 并影响组织结构和功能的恢复。当辐射超出机体的可耐受量时, 可造成机体多系统的严重损害, 包括分泌IL-1、IL-6及TNF-α的活性细胞, 使其含量升高不明显或反而下降。当然有关细胞因子导致局部损伤的病理生理机制还有待于更进一步研究。