2. 天津职业大学
在众多的诱变方法中, 离子注入技术作为一种特殊的物理化学复合诱变方法, 已日趋成熟。由于该技术具有较高的方向性和可控性, 所以产生的生物学效应比单一辐射更为丰富[1-3]。因此, 应用到多种工业微生物和农作物的诱变选育中。在其机理的研究中人们发现在离子注入情况下, 生物体内产生大量的氧自由基, 就其来源可能有两个方面:一是离子注入过程中初级反应的产物, 二是注入离子和移位原子沉积后空间位阻作用。
耐辐射球菌是一种微小的红色球菌。由于它对电离辐射和紫外线照射都具有极强的辐射抗性而受到广泛的关注。经过近五十年研究, 普遍认为, 造成其抗辐射的主要原因是高效的DNA修复功能, 特殊的生存方式和对氧自由基的有效清除[4-6]。如果将离子注入作为一种新的辐射手段研究耐辐射球菌中自由基的产生和消除无疑将推动耐辐射球菌抗氧化机理的分析[7]。同时也有助于从一个新的角度认识离子注入诱变的机理。因此, 本实验拟用大肠杆菌为对照, 研究γ射线和N+注入对耐辐射球菌氧自由基产生及其清除的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料与仪器 1.1.1 菌株抗辐射菌株Deinococcusr adiodurans ASl.633, 购于中科院微生物所。
1.1.2 培养基TGY液体培养基(g/L)、TGY固体培养基(g/L)、磷酸缓冲液(PBS)。
1.2 实验方法 1.2.1 菌体的培养将耐辐射球菌划线接种于TGY固体培养基上, 32℃下培养48h。挑取单一菌落接种于三角瓶中, 摇瓶培养至对数生长期(36h以上)。将液体种子按8%接种量, 接入发酵液体培养基(TGY)中, 于32℃培养36h。
1.2.2 菌株辐照 1.2.2.1 γ射线辐射菌液4 000r/min离心, 磷酸缓冲液洗, 用PBS调节使其OD为0.8。分装成9份, 每份2ml, 用60Coγ射线辐照(浙江大学核农学重点实验室), 剂量分别为0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、3.0、5, 0、7.0、9.0 kGy。大肠杆菌在同样条件下进行辐射。
1.2.2.2 离子注入取菌液0.1mL涂布在载玻片上, 无菌风吹干。把载玻片放入小靶室。以N+进行了辐照(中国科学院等离子体研究所)。将离子加速到30keV进行辐射, 剂量为0、15×1014、30×1014、45×1014、60×1014、75×1014ions/cm2·s, 大肠杆菌同样处理。
1.2.3 细胞提取物的制备γ射线辐射的菌液, 直接稀释并取5ml。离子注入的菌体, 用无菌刀片将其刮下, 并稀释成5ml。再用PB洗涤两次, 离心收集菌体。每克湿菌体加入3倍体积缓冲液制成菌悬液, 超声波破碎细胞(600W功率下处理7min, 每处理3s, 间隔3s。接着加入终浓度为0.01mg/mlRNaseA, 于37℃下温浴处理1.5h。12 000rpm离心20min, 收集上清液, 保存待用。大肠杆菌用类似方法处理。
1.3 分析方法离子注入的菌体用灭菌刀片刮下或将γ射线辐射的菌液水浴蒸干, 收集5mg进行ESR测定。ESR波谱测定在(20 ±20)℃下进行, 参数设置:X波段, 调频9.46GHz, 中心磁场3 370G, 调制1.25Gpp, 扫描宽度100G, 扫描时间100s。
2 结果与分析 2.1 不同剂量下自由基产生情况的分析不同剂量下, γ射线照射和离子注入后菌体自由基产生情况见表 1和表 2。
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表 1 γ射线辐射后菌体自由基变化 |
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表 2 离子注入后菌体自由基变化 |
从表 1中可以看出, 在0.1~0.5kGy辐射剂量内, 大肠杆菌自由基含量很高, 均在90%以上。而在0.7kGy以上, 自由基的含量几乎都为100%, 说明0.7kGy以上, 大肠杆菌完全死亡, 彻底失去清除自由基的能力。而耐辐射球菌在辐射剂量3kGy以下, 自由基的含量一直在32%以下, 远远低于大肠杆菌。只有到5kGy时, 自由基的含量才迅速增加, 达到100%。因此, 5kGy是耐辐射球菌所能承受的最大剂量。总体上, 耐辐射球菌的去除自由基能力明显强于大肠杆菌。
从表 2中可以看出, 离子注入后, 大肠杆菌自由基含量随着剂量的增加而提高。低剂量下, 大肠杆菌可能有一定的清除自由基的能力, 高剂量下这种能力丧失, 说明大肠杆菌对损伤的修复能力有限; 而耐辐射球菌自由基的含量先升高, 再下降, 最后再上升。说明耐辐射球菌在低剂量下的自由基清除的能力比较弱。随着剂量的升高耐辐射球菌自由基清除能力反而有一定幅度的提高, 出现这种反常现象很值得研究。
2.2 辐射后不同培养时间自由基的变化γ射线照射和离子注入后不同培养时间自由基的产生情况, 见表 3和表 4。
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表 3 γ射线照射后不同培养时间自由基的变化 |
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表 4 离子注入后不同培养时间自由基的变化 |
从表 3中可以看出, 大肠杆菌γ射线照射后自由基含量很高, 几乎没有被清除。而耐辐射球菌在3kGyγ射线照射下, 自由基的含量随着时间的延长, 自由基的含量逐步下降, 4h后降为24.1%。说明在耐辐射球菌启动了复杂而独特的自由基清除系统, 维持了菌体的生存, 这与有关的研究相一致。
从表 4中可以看出, 大肠杆菌可能在开始有微弱的自由基清除能力, 但这种能力很快消失。耐辐射球菌在经40×1014ions/cm2离子注入后自由基的含量随着培养时间的增加而不断下降, 8h后自由基含量降到32.1%。说明耐辐射球菌在较高的剂量下的自由基清除的能力比较强, 而在经15×1014ions/cm2离子注入后自由基的含量随着培养时间先下降再上升, 最后自由基含量维持在85%。说明耐辐射球菌在较低的剂量下只有开始有一定的自由基清除的能力, 但很快丧失。至于为什么出现这种现象是一个值得深入研究的问题。
3 讨论γ射线照射后, 相对于大肠杆菌, 耐辐射球菌的自由基含量低, 表现出了很强的抗性。高剂量的N+离子注入后, 耐辐射球菌自由基含量相对较低。低剂量的N+离子注入后, 自由基含量相对较高, 这显然有悖常理。出现这种情况, 作者推测与有关的修复系统没能启动有关, 即修复系统的启动可能有一定的剂量效应。进而还可能与离子注入存在入射粒子的沉积效应有密切的联系。至于其深层次的机理, 还需要做大量的多方面的研究。
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