宽筋藤是云南藏族和纳西族地区习用的高原植物药, 分布于广东、海南、广西、云南、西藏墨脱等地。性苦、寒。具有活血化瘀、舒筋活络、祛风除湿的作用^[1]。目前尚未见到文献报道关于其在辐射防护方面的研究。本研究通过对辐射损伤小鼠造血系统的影响来观察宽筋藤的辐射防护作用, 为进一步深入研究提供实验依据。

1 材料和方法 1.1 药物来源及制备

宽筋藤购自云南丽江药材公司。将宽筋藤加入70%乙醇3 000ml浸泡24h, 用乙醇回流法煮沸30min, 倾出液体, 得滤液, 重复操作二次, 合并滤液, 静置12h以上。取上清液回收乙醇, 浓缩成浸膏, 置于85℃烘箱中烘干。得醇提物粉末。药物临用前用蒸馏水配制成相应浓度, 并经0.45um微孔滤膜除菌。

1.2 主要试剂及仪器

RPMI-1640培养液(GIBCO公司), 高氯酸(天津鑫源化工厂), 氯化钙(成都金山化工试剂厂), 冰醋酸(重庆川江化学试剂厂), 苦味酸(广东合山化工厂), 乙二胺四乙酸二钾(上海试剂一厂), ⁶⁰Co远距离治疗机(国产, GWGP80型), 血细胞计数仪(Sysmex公司, KX-21N), 分光光度计(Kyoto公司, UV-190), 高速水平离心机(国产, TGL-168), 电子天平(Sartorius公司, BP310S, BP3100S), 普通光学显微镜(Olympus公司, CX-31), 烘箱(国产, 2002020001)。

1.3 实验动物

健康SPF级昆明种小鼠50只, 雄性, 体重18 ~ 22g, 6 ~ 8周龄。由昆明医学院实验动物中心提供。

1.4 照射条件

用⁶⁰Coγ射线一次性全身均匀照射, 剂量率3.2s/cGy, 照射野25 cm×25 cm, SSD80cm, 照射剂量6Gy, 在云南省肿瘤医院放射治疗中心进行。

1.5 方法

小鼠随机分为5组, 每组10只。实验组:给予⁶⁰Coγ射线6Gy一次性全身照射, 照射后第2天, 分别给予0.984 g/kg/d(高剂量组)、0.492 g/kg/d(中剂量组)和0.246 g/kg/d (低剂量组)灌胃, 连续14d。另设阴性对照组(生理盐水)及照射对照组(⁶⁰Coγ射线6Gy照射+生理盐水)

1.6 观察指标 1.6.1 血象分析映

于照射当天, 取小鼠尾血约250μl加EDTA-K₂ 20μl抗凝, 送云南省肿瘤医院检验科自动分析仪检测。分别于照射后第7、14天, 再各取血1次, 测量白细胞, 红细胞, 血小板值。

1.6.2 骨髓有核细胞计数

照射后14d脱臼处死小鼠, 置超净工作台, 解剖小鼠, 取其左侧股骨, 用7号针头刺穿股骨末端, 再用10 ml RPMI1640培养液冲洗骨髓, 至少冲洗10遍, 直至股骨冲为白色为止, 将冲出的骨髓液通过4号针头过滤待用, 取10μl混匀的骨髓细胞溶液, 加入冰醋酸, 充分混合, 然后滴入计数板, 在显微镜下计数有核细胞。有核细胞数(L)=4个大方格有核细胞总数/4 ×10⁴ ×稀释倍数。

1.6.3 骨髓DNA含量测定

取其右侧股骨, 剔去肌肉, 用生理盐水冲洗干净, 剪去两端骨骺, 用7号针头刺穿股骨末端, 用5mmol/l的CaCl₂ 10 ml冲洗骨髓, 将全部骨髓冲入离心管中, 至少冲洗10遍, 直至股骨冲为白色为止。4℃冰箱放置30min, 然后2 k 500rpm离心15min, 弃上清液。加入0.2mol/l的HClO₄ 5ml将沉淀物充分混匀, 90℃加热15min, 冷却, 用滤纸过滤, 滤液用紫外分光光度计在268nm处测定吸光度A₂₆₈值。按下列公式计算每根股骨所含DNA(μg):DNA(μg)=40 ×50 × A₂₆₈。

1.6.4 脾结节计数(CFU-S)^[2]

照射后14d脱臼处死小鼠, 取其脾脏, 称重后, 将脾脏放入Bouin' s液(用苦味酸饱和水溶液、37% ~ 40%福尔马林液、冰醋酸按体积以15:5:1混合)固定24h, 取出后冲洗干净, 肉眼计数脾脏表面的白点, 即脾结节数。

1.7 统计学处理

统计学分析采用spss12.0软件进行处理, 所得数据均用均数±标准差(x±s)表示, 统计方法使用单因素方差分析(one-wayANOVA), 以a=0.05作为检验标准。

2 结果 2.1 宽筋藤照后给药对小鼠血象的影响 2.1.1 对小鼠白细胞的影响

小鼠接受⁶⁰Coγ射线6Gy照射后, 白细胞数明显降低(P < 0.05), 照后给予宽筋藤组, 与照射对照组相比, 可促进白细胞的恢复, 但无统计学差异(P> 0.05)。见表 1。

2.1.2 对小鼠红细胞的影响

由表 2可以看出, 各照射组小鼠红细胞数明显降低, 无论照后第7、14天, 各照射组红细胞数与阴性对照组相比, 差异均有统计学意义(P < 0.05);照后给药可减缓红细胞的下降, 高、中、低剂量组均有较好的保护红细胞的作用, 3个给药组红细胞数与照射对照组相比, 差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图 1。

2.1.3 对小鼠血小板的影响

实验结果表明:各照射组小鼠血小板数明显降低, 在照后14d下降更明显。照后第7、14天各照射组小鼠血小板数与阴性对照组相比, 差异均有统计学意义(P < 0.05);宽筋藤高、中、低剂量组对血小板保护作用较显著, 3个给药组血小板数, 与照射对照组相比, 差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 3, 图 2。

2.2 宽筋藤照后给药对小鼠骨髓DNA含量、有核细胞数及脾结节的影响

从表 4可以看出, 4个照射组小鼠骨髓DNA含量下降明显, 与阴性对照组相比, 差异有统计学意义(P=0.000), 中、低剂量组与照射对照组相比, 差异有统计学意义(P < 0.05), 说明宽筋藤对骨髓DNA有保护作用; 而有核细胞计数, 药物组与阴性对照组比较, 差异无统计学意义(P>0.05), 说明宽筋藤能促进髓外造血, 保护骨髓造血功能, 中剂量组与照射对照组相比, 差异有统计学意义(P < 0.05);照射后小鼠出现脾结节, 宽筋藤低剂量组与照射对照组相比, 差异有统计学意义(P < 0.05)。以上说明宽筋藤对造血系统的保护作用可能是通过促进造血干细胞增殖分化, 保护骨髓DNA来实现的。

2.3 宽筋藤照射前给药对各项指标的影响

本实验在宽筋藤照后给药对辐射损伤小鼠造血功能有保护作用的基础上, 进行了照前给药实验。我们期望预防用药能够减轻辐射后引起的造血系统损伤, 但实验结果并不像我们所预期的那样, 预防用药不仅不能保护外周血象, 相反, 宽筋藤照前给药组外周血象较照射对照组更低。预防用药不如治疗用药的可能原因, 可能是预防用药促使照射前造血细胞增殖活跃, 大量祖细胞从G₀期转入G₁期, 较多的放射敏感细胞在照射时被杀伤, 不利于造血的恢复有关^[5]。

3 讨论

辐射可以导致机体各系统的损伤, 尤其对于更新活跃、增殖旺盛的造血系统常造成较为严重的损伤。由于造血系统受到辐射后损伤早而重, 其辐射修复能力却相对较弱, 而造血系统又承担着机体适应防御、维持机体生命活动的重要功能。因此, 电离辐射后常引起造血功能低下甚或衰竭, 骨髓抑制, 造血微环境损伤, 白细胞、红细胞和血小板数明显减少, 从而诱发感染、贫血、出血等并发症^{[3, 4]}。辐射所致损伤的临床表现, 从中医学角度认识, 应归属于中医学“虚劳”等疾病范畴。而造血功能损伤中医学认为其证候主要为精血不足、气血亏虚。因此, 依据中医“虚者补之”的原则, 我们所选药物宽筋藤具有“补益气血”的基本作用。本实验发现:小鼠接受⁶⁰Coγ射线6Gy全身照射后, 照射组小鼠外周血白细胞、红细胞、血小板明显降低。照射后给予宽筋藤, 可促进辐射损伤小鼠外周血红细胞、血小板的恢复。

DNA是生命信息的载体, 是细胞中最重要的生命大分子之一, 也是电离辐射的重要靶分子之一, 放射生物学效应很多是通过DNA损伤表现出来的。DNA不但是辐射直接作用的靶点, 也是辐射所产生的自由基间接攻击的目标之一, 最终引起DNA断裂、基因突变、染色体重组、细胞转化和细胞死亡等。其最终结果也可导致造血细胞的增殖抑制。骨髓的辐射损伤和恢复是外周血细胞数辐射后减少和回升的前提。造血组织中多能造血干细胞增殖分化的中心环节是DNA的合成。本实验结果显示:宽筋藤中、低剂量组骨髓DNA含量明显提高, 中剂量组可促进骨髓有核细胞增殖。提示宽筋藤对骨髓DNA损伤有一定的促修复作用, 骨髓有核细胞损伤的恢复可能与DNA损伤修复有关。

CFU-S测试是最早、最经典的造血干细胞的测试手段^[2]。CFU-S是动物受到低于致死量射线照射后, 体内存活的小量造血干细胞在脾中增殖、分化, 最后生成一定数量和大小不等的脾集落。它能代表动物经照射后体内存活的造血干细胞的水平。造血干细胞是产生各系血细胞的最原始的细胞, 它们是维系机体正常造血功能的重要保障; 也是造血辐射损伤后得以重建的关键细胞。因此, 脾结节计数可间接反映残存造血干细胞的增殖分化能力, 提示骨髓辐射损伤的重建恢复能力。所以脾结节计数是观察抗辐射药物的可靠方法^[4]。脾结节计数有内源性脾结节法, 外源性脾结节法。本实验采用内源性脾结节法。本实验结果显示:宽筋藤能增加受照小鼠CFU-S的数量, 提示宽筋藤对外周血象的保护作用一方面可能是通过促进骨髓造血干细胞的分化、增殖而实现的。

总之, 宽筋藤照后给药对辐射引起的血液系统损伤具有很好的保护作用。其作用机制可能是:宽筋藤促进骨髓细胞DNA的损伤修复, 促进骨髓有核细胞损伤恢复, 促进骨髓造血干细胞的分化、增殖, 最终加快辐射后外周血象的恢复有关。宽筋藤可能是个有希望的辐射防护药物, 其具体作用机理, 值得作进一步研究。