研究发现^{[1, 2]}, PUMA基因转染可促进体外肺癌和食管癌细胞凋亡, 并能增强肺癌和食管癌细胞对放化疗的敏感性。我们曾将野生型PUMA转染胰腺癌Aspc-1细胞, 发现Aspc-1细胞的生长明显被抑制^[3]。本试验旨在研究转染野生型PUMA基因的胰腺癌Aspc-1细胞是否增强对γ射线照射的敏感性。

1 材料与方法 1.1 细胞株和其他主要材料

胰腺癌细胞系Aspc-1购自中科院上海细胞所, 细胞株用含10%的胎牛血清的1640培养基培养, 细胞培养条件为37℃恒温, 饱和湿度和5%CO₂, 指数生长的细胞为实验对象。鼠抗人PUMA多克隆抗体购自Cell Signals公司, MTT、TUNEL和Western blot试剂盒购自北京中山; 1640购自Gibco其他试剂均为国产分析纯。

1.2 病毒扩增^[4]

Ad-PUMA由北京正阳基因技术公司和苏州大学附属第一医院普外科实验室共同构建。在293细胞内扩增使病毒滴度达到l ×10⁹ ~ l ×10¹⁰Pfu(plaque form ingunits)/ml, 同样扩增等滴度的Ad-CMV病毒(Ad-CMV)作对照。

1.3 Ad-PUMA转染

Aspc-1细胞取1瓶呈对数生长期的细胞弃掉培养液, 无菌磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次后, 加入病毒感染倍数(MOI)为50的的腺病毒溶液(Ad-PUMA)和Ad-CMV, 对照组加入等量PBS, 37℃、5% CO₂温箱中培养。每15 min摇晃培养瓶1次, 2 ~ 3 h后弃病毒液, PBS漂洗3次后, 加入含2%FBS的1640培养液继续培养。48 h后弃培养液, PBS冲洗1次, 固定液固定2h, 弃固定液, PBS洗3次, 吸净PBS。

1.4 Western blot检测细胞PUMA蛋白

收获细胞并提取细胞总蛋白, 经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 转移到硝酸纤维索膜, 用PUMA多克隆抗体行Western blot杂交, 电化学发光(ECL)试剂显色, 检测细胞中转染PUMA后的蛋白表达情况。

1.5 Aspc-1细胞射线照射

在室温条件下, 将Aspc-1三组细胞(空白组、Ad-CMV和Ad-PUMA组)以6Gy γ射线照射, 之后继续孵箱中培养24h并行相应的检测。

1.6 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制率

0.25%胰蛋白酶消化单层经γ射线照射后已转染PUMA腺病毒的Aspc-1细胞, 用含10 %FBS的RPMII 640全培养基制成细胞悬液, 每孔1 ×10⁴个细胞接种于96孔板.每组均以转染Ad-CMV的Aspc-1细胞为对照.每孔加入MTT 10μL, 37℃ 4h后弃上清液, 加入二甲基亚砜(DMSO) 100 μL /孔, 振荡10min左右, 置酶标仪测A值, 波长为570nm。胞增抑制率% = (1-试验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%, 实验重复3次。

1.7 细胞克隆形成试验

收集三组细胞接种在24孔培养板, 每孔含细胞数2 ×10²个, 分别加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基100μl, 甲基纤维素浓度为0.7%, 培养至第14天时计数细胞克隆数, 以大于或等于40个细胞者为一个克隆, 克隆形成率= (克隆数/接种细胞数)×100%。实验重复三次。

1.8 末端

脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡将盖玻片上的Aspc-1细胞用PBS充分冲洗, 冷丙酮固定2min, 用3%双氧水溶液处理10min, 0.2%TritonX-100孵育2min破膜, PBS漂洗, 滴加TUNEL反应液, 孵育2h, PBS漂洗后加POD转换剂, 温室孵育30min, DAB显色。苏木素复染, TUNEI反应液中不加末端脱氧核苷酸转移酶作为阴性对照。以凋亡细胞占同一视野内细胞总数的百分比表示细胞凋亡指数(AI):即AI=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.9 统计学方法

两组间计量资料差别的显著性检验采用t检验, P < 0.05有统计学意义。

2 结果 2.1 PUMA蛋白表达测定结果

细胞单独γ射线照射后, PUMA蛋白表达增加, 与对照组比差异有显著性(P < 0.05);转染Ad-PUMA联合γ射线照射后蛋白表达增加更加明显, 与单纯γ射线照射和单纯转染Ad-PUMA比差异分别有统计学意义(P < 0.01, P < 0.05); PUMA蛋白表达在Ad-puma转染组明显高于Ad-CMV转染组, 而对照组与Ad-CMV组比差异无显著性(P >0.05)。

2.2 PUMA基因治疗与放疗联合应用对Aspc-1细胞生长的作用

Ad-PUMA联合6Gy γ射线照射后生长抑制率为(59.6 ±2.7) %, 分别高于转染Ad-PUMA的Aspc-1细胞(32.3 ± 2.5) %和单独6Gy γ射线照射后的Aspc-1细胞(10.2 ± 1.5) %, 差异分别有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01);转染Ad-PUMA基因的Aspc-1细胞生长抑制率高于单纯转染Ad -CMV的细胞(1.52 ±0.38) %, 差异有统计学意义(P < 0.001); Ad-CMV联合6Gy照射后的生长抑制率为(11.6 ± 1.7) %, 低于Ad-PUMA联合6 Gy放疗后生长抑制率, 差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.3 细胞克隆形成试验

Ad-PUMA联合6Gy γ射线照射后克隆形成率为1.67%, 分别低于转染Ad-PUMA的Aspc-1细胞4.2%和单独6 Gy γ射线照射后的Aspc-1细胞10.8%, 差异分别有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01);单独转染Ad-PUMA的Aspc-1细胞克隆形成率低于转染Ad-CMV的Aspc-1细胞的克隆形成率13.79%, 差异有显著性(P < 0.01)。Ad-CMV联合6 Gy γ射线照射后的克隆形成率为(9.6 ±1.7) %, 高于Ad-PUMA联合6 Gy γ射线照射后克隆形成率, 差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.4 细胞调亡检测

Ad-PUMA联合6 Gy γ射线照射后AI为(61.9 ±5.5) %, 分别高于单独转染Ad-PUMA的Aspc-1细胞(29.6 ±1.9) %和单独6 Gy γ射线照射后的Aspc-1细胞(11.4 ± 1.43) %, 差异分别有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01);单独转染Ad-PUMA的Aspc-1细胞的AI高于单独转染Ad-CMV的细胞AI (2.16 ±0.61) %, 差异有统计学意义P < 0.01; Ad-CMV联合6 Gy γ射线照射后的AI为(11.3 ±1.68) %, 高于Ad-PUMA联合6 Gy γ射线照射后AI, 差异有统计学意义(P < 0.01)。

3 讨论

尽管放疗仍然是肿瘤的主要治疗手段之一, 由于其对肿瘤组织缺乏特异性, 临床治疗剂量可造成周围正常组织严重损伤。同样, 作为新技术的基因治疗也或多或少存在着不足, 如对肿瘤组织缺乏特异性, 治疗基因表达水平有限、潜在的生物危险等。为此, Weichselbaum于1992年首次提出了肿瘤基因-放射治疗。基因治疗和放射治疗联合可望进一步提高疗效, 或在保证疗效的前提下, 进一步降低临床治疗的各自剂量, 以减少对正常组织的损伤, 提高基因治疗的生物安全.

PUMA是新近发现的p53下游促凋亡基因, 是bcl-2家族BH-3亚家族中的成员。Jeffers^[5]等发现野生型p53在PUMA缺失时并不能诱导凋亡, 说明PUMA在p53诱导凋亡途径中是必需的。Nakano等^[6]发现, 体外转染外源性PUMA基因可以诱导肿瘤细胞的快速凋亡和抑制集落形成, 转染外源性PUMA基因对集落形成的抑制能力高于转染p53基因。

我们的实验发现, 细胞单独转染Ad-PUMAMOI50后, 细胞凋亡率和生长抑制率分别高于对照组和Ad-CMV组, 两周后的克隆形成率低于Ad-CMV组和对照组, 说明Ad-PUMA转染能促进胰腺癌细胞凋亡并抑制其生长。

在p53凋亡诱导通路中, PUMA位于p53的下游, 而且还可以不依赖于p53诱导凋亡^{[7, 8]}, 这就为外源导入p53诱导凋亡效果不好的胰腺癌肿瘤提供了新的可能的治疗靶点。

Yu^[1]和Wang^[2]等发现, 腺病毒介导的PUMA基因转染除了促进肺癌和食管癌细胞凋亡外, 还明显增强肺癌和食管癌细胞对放化疗的敏感性。在本试验中, 转染Ad-PUMA的胰腺癌细胞受到6Gyγ射线作用后, 细胞凋亡率和生长抑制率明显高于单独转染Ad-PUMA组和单独放射组, 两周后的克隆形成率也明显低于单纯Ad-PUMA组和单纯放射组, 并且联合治疗效果大于单独转染Ad-PUMA和单独放射的效用之合.说明放射和Ad-PUMA联合可增强治疗效果。

多个实验证实, 转染外源性p53基因或由γ射线照射、DNA损伤药物等引起内源性P53表达上调引发的促细胞凋亡作用是通过上调PUMA基因表达介导的, PUMA表达缺失或突变都会导致凋亡率降低^{[5, 7-9]}。在本试验中, γ射线引起胰腺癌细胞内PUMA蛋白增加的同时出现细胞凋亡率提高和细胞生长的抑制.说明γ射线的治疗作用是通过增加PUMA表达实现的.因此, γ射线联合Ad-PUMA治疗可在低剂量射线的作用下取得相同的治疗效果, 减少射线的副作用。