2. 绍兴文理学院
心肌细胞凋亡程度对于房室间隔、瓣膜及血管结构的正常形成有重要作用。在胎儿发育过程中, 心脏细胞凋亡过程对外界因素特别敏感, 凋亡过度可导致缓慢型心律失常与猝死。诊断级多普勒超声照射胚胎后诱导小肠上皮细胞、绒毛组织凋亡的研究已表明, 高强度聚焦超声可诱导细胞凋亡, 并与其强度有关。以此推论, 诊断级二维超声(尤其指高频率高声强超声)可能会影响胚胎心肌细胞的凋亡。虽然超声诱导细胞凋亡的确切机制、基因调控、蛋白表达目前尚不清楚, 但是从理论上讲, Bcl-2家族的原癌基因在凋亡的调节中起着非常重要的作用, 尤其是Bcl-2和Bax的拮抗调节起到了核心的作用。凋亡促进基因Bax及凋亡抑制基因Bcl-2的表达极易受到外界因素的影响, 故超声有可能诱导Bax及Bcl-2的表达改变。为此, 我们试图设计实验验证超声诱导心肌细胞凋亡及影响Bax、Bcl-2表达的实验假设。
1 材料与方法 1.1 实验动物 1.1.1 实验动物及分组健康性成熟的Wistar大鼠43只(浙江大学医学院实验动物中心提供), 雌性36只, 体重330~ 390g;雄性7只, 体重450~470g。选自然发情期雌鼠与雄鼠按1:1合笼, 次日晨做阴道涂片, 查到精子之日为受孕0d, 以此计算孕龄(每批保证有6只孕鼠)。将每批6只孕鼠随机分为6组, 分别为2.5MHz照射10min、7MHz照射10min、10min对照组、2.5MHz照射40min、7MHz照射40min、40min对照组(见表 1), 同一日进行实验。
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表 1 超声对活鼠胚胎心肌细胞凋亡影响的研究实验分组 |
将受孕14d母鼠用3%戊巴比妥钠按3ml/kg体重的剂量腹腔麻醉后仰卧固定于架子上, 于下腹部外涂耦合剂, 沿大鼠子宫V型分布的体表投影区扫查V型分布区的一侧, 分别使用2.5MHz、7MHz的探头, 对照组进行假辐照, 其余条件一律同辐照组(表 1)。照射后标记扫查的一侧腹部。
1.2 仪器及试剂用迈瑞DP8800型超声诊断仪, 频率7MHz探头, Isppa=227W/cm2, Ispta=385mW/cm2; 频率2.5MHz探头, Isppa=94.5W/cm2, Ispta=15.6mW/cm2, 全部声学参数由迈瑞公司提供。所用试剂包括:TUNEL试剂盒(武汉博士德公司)、免疫组化试剂盒(武汉博士德公司), 兔抗Bcl-2抗体(武汉博士德公司)、兔抗Bax抗体(武汉博士德公司)。所用电镜为JEM-1011型透射电镜。
1.3 实验方法 1.3.1 标本的制备孕鼠辐照后24h剖腹取胎, 每只孕鼠按照相同空间位置取2只胎鼠, 用4%多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋后连续冠状切片。每只胎鼠任取6张胎心切片。每只孕鼠另取1只胎鼠, 分离胎心, 迅速用2.5%戊二醛固定(作为电镜样本)。
1.3.2 Bcl-2蛋白的免疫组化染色每只胎鼠任取2张胎心切片。组织切片常规脱蜡, 梯度酒精入水后, 3%H2O2孵育, 抗原修复液修复, 羊血清封闭。Bcl-2抗体(效价1:150)孵育, 羊抗兔IgG孵育, ABC复合物孵育, DAB显色, 苏木素轻度复染。光镜下观察, 胞浆内着棕黄色者为阳性细胞。
1.3.3 Bax蛋白的免疫组化染色每只胎鼠任取2张胎心切片。组织切片常规脱蜡, 梯度酒精入水后, 3%H2O2孵育, 抗原修复液修复, 羊血清封闭。Bax抗体(效价1:150)孵育, 羊抗兔IgG孵育, ABC复合物孵育, DAB显色, 苏木素轻度复染。光镜下观察, 胞浆内着棕黄色者为阳性细胞。
1.3.4 TUNEL法检测细胞凋亡每只胎鼠任取2张胎心切片。石蜡切片常规脱蜡入水后, 3%H2O2孵育, 蛋白酶K消化, TdT、DIG-dUTP及标记缓冲液1:1:18混合加于切片上标记, 加封闭液、封闭液1:100稀释的生物素化抗地高辛抗体及TBS液1:100稀释的SABC, DAB显色, 苏木素轻度复染。光镜下观察, 细胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。
1.3.5 电镜检测细胞凋亡样本固定、脱水、染色、切片处理后进行透射电镜观察。
1.4 数据处理所有数据采用SPSS11.0软件进行处理, 当P < 0.05时为有统计学显著性差异。
2 结果 2.1 Bcl-2及Bax蛋白免疫组化结果每张切片随机取10个400倍高倍镜视野, 细胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞。评分标准:按着色强度评分, 大致无着色0分, 大致浅黄色1分, 大致浅棕色2分, 大致深棕色3分; 按阳性率评分, < 5%为0分, 5%~25%为1分, 26%~50%为2分, 51%~75%为3分, >75%为4分。将阳性率和着色强度两项评分乘积进行评价, 结果分为3级:0~4分为阴性表达(-); 5~8分为弱阳性表达(+); 9~12分为强阳性表达(++)。见表 2。光镜下观察并使用SPSS11.0统计软件统计后得出, 同一样本不同胚胎间差异无显著性(P>0.05)。7MHz照射40min组胎鼠心肌组织Bcl-2(+), Bax蛋白(+), 2.5MHz照射40min组胎鼠心肌组织Bcl-2(+), Bax(-), 7MHz照射10min组胎鼠心肌组织Bcl-2(+), Bax蛋白(-), 2.5MHz照射10min组胎鼠心肌组织Bcl-2(+), Bax(-), 两组对照组两者均为(-)(图 1、2)。Bcl-2在7MHz照射10min组及2.5MHz照射10min组较对照组有表达增加的趋势, 7MHz照射40min组较7MHz照射10min组表达下降。
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表 2 超声对活鼠胚胎心肌细胞凋亡影响的研究实验结果 |
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图 1 BCL-2免疫组化结果图片 |
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图 2 Bax免疫组化结果图片 |
每例切片随机取400倍视野, 随机计数1 000个细胞, 以100个细胞内所含阳性细胞数作为凋亡指数(AI), 使用SPSS11.0统计软件, 显示同一样本不同胚胎间差异无显著性(P>0.05)。采用多个样本均数比较的方差分析显示, 7MHz照射40min组较对照组凋亡差异有显著性(P < 0.05), 其余各组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)(图 3)。
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图 3 TUNEL法检测结果图片 |
扫描电镜观察发现, 7MHz照射40min组可见细胞核膜皱缩, 细胞核缩小, 染色质聚集, 染色加深, 核内可见空泡样现象。其余各组此类改变现象较轻(图 4)。
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图 4 7MHz照射40min组透射电镜结果图片 |
超声诊断技术在围产医学中已成为一种重要的诊断手段, 诊断超声对胚胎组织所产生的生物效应及其安全性越来越受到国内外学者的关注。AIUM声明:在Ispta值低于100mW/ cm2时, 人体超声扫描和动物试验均未见有害生物效应的报道。但实际应用的超声强度往往大于100mW/cm2。已有大量的研究表明诊断剂量超声可能对胚胎产生潜在或微弱的有害的生物效应。OH[1]等发现诊断超声可引起胎鼠小脑外颗粒层细胞及成鼠小肠隐窝细胞凋亡, 提出可用凋亡作为超声安全性研究的生物学指标。应用凋亡指数的变化判断诊断剂量超声是否对胚胎组织细胞构成损伤是目前研究的热点。Stanton[2]用诊断超声辐照鼠的小肠, 用频率8MHz、空间峰值时间平均值声强Isapa1120W/cm2的相控阵探头辐照鼠的腹部15min, 温度变化约1℃, 在辐照后的1、3、4、5h, 其凋亡小体数目与对照组比较有显著差异。杜联芳[3]用诊断超声对大鼠幼仔睾丸组织凋亡情况进行了研究, 应用HP8500彩色多普勒超声诊断仪, 探头频率7.5MHz、空间平均时间平均声强Isapa为3.4W/ cm2, 辐照时间为30min, 结果发现实验组与对照组细胞凋亡数有显著差异; 又用彩色多普勒超声持续照射大鼠眼球30min, 照射后即刻太鼠角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的凋亡率无差异, 照射后12h凋亡细胞增加, 24h增加最多, 48h凋亡率下降[4]。国内有报道[5], 诊断超声辐照中孕期胎儿心脏30min, 心肌细胞核染色质细颗粒状分布稀少, 胞浆中心肌纤维分布量少, 线粒体嵴模糊, 结构不清楚, 部分胞浆区缺乏细胞器, 细胞间隙增宽, 靠近毛细血管旁组织结构疏松。至于超声诱导细胞凋亡的确切机制, 如基因调控、蛋白表达等目前尚不清楚[6]。
Bcl-2家族在凋亡的调节过程当中扮演着重要的角色。目前已发现的Bcl-2家族成员有抑制细胞凋亡的Bcl-2、Bcl -X1、BHRF1、Ced-9, 促进细胞凋亡的Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak, 及参与细胞存活调节的Mcl-1、A1等。其中Bax基因长415kb, 含6个外显子, 可通过不同的剪接方式编码3种蛋白, Bax-α、Bax-β、Bax-γ。Bax蛋白由192个氨基酸组成, 分子量21kb, 分子中含1条跨膜主干, 与Bcl-2蛋白有21%同源性。研究发现, Bax基因功能与Bcl-2相反, 两者相互拮抗, Bcl-2/Bax比值决定细胞受到凋亡刺激时是生存还是死亡, Bcl-2蛋白占优势时细胞趋于存活; Bax蛋白占优势时细胞凋亡趋于凋亡, Bax是重要的细胞凋亡基因[7, 8]。
本实验利用不同声强的超声探头辐照孕14d的Wistar大鼠, 24h后取胎, 通过免疫组化技术检测胎鼠心肌Bcl-2及Bax蛋白的表达情况, 通过TUNEL法及电镜技术检测心肌细胞的凋亡情况。其中TUNEL法显示7MHz(Isppa=227W/cm2, Ispta=385mW/cm2)照射40min组较其他组凋亡明显增加, 而其他组与对照组相比凋亡不明显; 电镜显示7MHz(Isppa= 227W/cm2, Ispta=385mW/cm2)照射40min组呈现较多程度较为类似的早期凋亡现象, 其他组凋亡细胞较少, 程度不均一。说明高频率高强度超声长时间辐照下, 可一定程度上导致大鼠胚胎心肌细胞的凋亡, 而低强度超声(Isppa=94.5W/cm2, Ispta =15.6mW/cm2)辐照可能不影响大鼠胚胎心肌细胞的凋亡。实验结果与AIUM的声明相吻合。另外, 高频率高强度超声随着照射时间的增强, Bax蛋白的表达明显增加。而Bcl-2在小剂量短时间照射时有表达增加的趋势, 随着照射时间及强度的增加表达减少。表明在小剂量短时间超声照射下, 机体有可能存在自身保护反应抑制细胞凋亡, 随着超声强度的增大, 该反应减弱, 当照射强度达到一定程度时, 凋亡则会不可避免地发生。一些实验表明, 低剂量超声能促进细胞的增殖。Reher[9]用1MHz的脉冲超声(空间平均时间平均声强Isapa:0.1、0.4、0.7、1.0mW/cm2)和45kHz的脉冲超声(Isapa:5、15、30、50mW/cm2)处理培养的牙龈成纤维细胞、下颌成骨细胞, 以DNA合成反映细胞增殖情况, 实验显示:成纤维细胞DNA合成率分别增加了47(0.7mW/cm2, 1MHz)、41(50mW/cm2, 45kHz), 成骨细胞DNA合成率分别增加了52(1.0/mWcm2, 1MHz)、35(30mW/cm2, 45kHz); Doan[10]也对超声处理后的成纤维细胞、下颌成骨细胞增殖情况也进行了研究。用频率为45kHz(声强为30Mw/cm2、15mW/cm2)的超声和频率为1MHz (声强为100mW/cm2、400mW/cm)的超声分组辐照, 发现细胞增殖加速, 频率为45KHz组更明显。但是超声导致细胞增殖的机制一直没有明确的结论。通过该实验发现小剂量的超声波可以促进Bcl-2表达来抑制细胞凋亡, 是否是导致低剂量超声促进细胞增殖的原因之一呢!相关的机制值得我们进一步探索。
本实验显示, 诊断级高频率高声强二维超声可导致胚胎心肌细胞的凋亡, 凋亡调节基因Bcl-2及Bax参与了该过程的调控。由于超声影响下的细胞凋亡的调节是一个非常复杂的过程, Bcl-2家族的其他分子是否参与, 其他种类的凋亡调节因子是否参与, 其具体的过程如何, 尚需要我们进一步研究。可以肯定的是, 关于超声影响下的凋亡机制的研究必将为超声生物学效应的应用和预防产生重要影响。
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