20世纪90年代随着细胞分子生物学和肿瘤分子生物学的一系列突破, 人们认识到大多数癌基因与抑癌基因的功能效应最终都参与细胞周期的调控, 或者本身就是细胞周期的调控的主要部分, 这些基因的突变, 导致细胞周期的失控, 使细胞增殖过多, 调亡过少。真核细胞对于辐射的反应与细胞周期的时相具有明显的相关性。射线对于肿瘤细胞的杀伤作用主要是损伤肿瘤细胞的DNA, 受射线损伤的细胞会停滞于细胞周期的某些时相, 对于受损的DNA进行修复, 如果修复成功, 细胞继续运行并进一步进入下一个周期; 否则将通过启动细胞调亡的方式清除受损伤DNA的肿瘤细胞。细胞周期的完成, 依赖于紧密的顺序和强制的次序, 这些需要细胞周期检测点(cell cycle checkpoints)来完成, 以保证细胞复制的忠实性。目前研究较多的细胞周期检测点主要有G1-S期检测点、G2-M期检测点, 其中G1期又称DNA合成前期, 位于S期之前, 是细胞增殖的关键时相; 而G2期为DNA合成后期, 位于M期之前。检测点(checkpoint)又称关卡, 是在细胞周期的暂停中允许编辑和修复遗传信息, 并使每个子细胞接受与亲代细胞相同的整套遗传信息.作为一保护机制在肿瘤细胞的生命活动中起着十分重要的作用。细胞周期的运做依赖一共同的核心装置:既周期蛋白/周期蛋白依赖性蛋白激酶、(cycling/cycling dependent kinase, CDK)。细胞周期不同时相有不同的cycling和CDK表达, 通过不同cycling含量的改变调控细胞周期的进程。

1 G1-S期检测点的调控

传统的认识G1-S期检测点主要依赖p53蛋白的表达和cyclinD、cyclinE。当细胞出现DNA损伤时, p53是细胞进入S期的控制者。如果p53失活, 即便细胞周期还能正常进行, 细胞也会停止DNA损伤修复, 导致凋亡。Sur等通过对8例食道癌患者进行近距离放射治疗后, 对肿瘤组织P53表达情况进行免疫组化检测, 结果表明, 所有患者的P53表达均为强阳性, 并且与放疗前对比, 在肿瘤区出现P53浓聚^[1]。P53基因被激活, 触发下游基因的表达, 转录激活一个关键靶蛋白P21(细胞周期依赖激酶相互作用蛋白), P21通过抑制cyclingE/CDK2活性, 导致细胞周期的阻滞。有研究表明P21蛋白是通过多种途径进行抑制cycling/CDK复合体的活性^[2]。cyclinD上调可加速细胞周期的进行, 使细胞逃避检测点, 其与CDK4形成cyclinD/CDK4复合体, 轻度磷酸化PRb, 使组蛋白脱乙酰酶从DNA-CDK4结合体中释放, 使某种Rb沉默基因被激活, 但其他E2F-Rb调节的基因仍被抑制^[3]。Kahl等发现在人二倍体成纤维细胞, 钙调节蛋白依赖性蛋白激酶Ⅰ的活性为G1进程cyclinD/CDK4复合体激活所必须的^[4]。cyclinE/CDK2也是G1/S期过渡所必须的, cyclinE/CDK2进一步磷酸化Rb成高磷酸化, Rb完全释放E2F转录因子, E2F又进一步激活DNA合成复制的基因, 同时激活cyclinE, cyclinE转录又通过磷酸化Rb进一步激活E2F, 这一正反馈使得限制点不可抑制的进入S期。因此cyclinD与cyclinE对Rb的时序磷酸化, 激活E2F是G1/S期关键调节机制。但Keenan等发现不需要cyclinD/CDK4, cyclinE/CDK2也能磷酸化Rb, 激活E2F^[5], 这可能提示存在不同的信号转导机制。CDKIS包括CIP/KIP及INK4两大家族, 是G1/S周期负性调节因子, 其作用机制通过与周期蛋白竞争性结合CDK, 并使其亚单位催化失活, 抑制CDK/cyclins复合物的活性。研究显示INK4抑制剂通过激酶催化裂口变形和干扰ATP结合来抑制CDK4/6-cyclinD复合体^[6]。另外除了P53及Rb基因是涉及G1/S周期控制的主要抑癌基因外, 还有HSNF5/INI1基因、E2F基因、P16基因等多种基因、泛素及细胞信号转导系统参与周期的调控。

2 G2期检测点的调控

G2期检测点途径主要是cyclinA及yclinB1的上调, 抑制Cdc2(cell division cycle)即(CDK1)活性, 使细胞阻滞在G2期。其中cyclinA/CDK2的结合与G2期事件启动和进行的必要条件。CyclinB1/CDK1是G2/M期必需的。电离辐射诱导的G2期阻滞的途径, 包含P53依赖型及P53基因非依赖型。P53基因依赖型P53分子分别通过直接或间接的调控P21、gadd45(P53基因调控蛋白)和14-3-3sigma(是通过结合和分离磷酸化蛋白质, 调节细胞活性的蛋白质家族成员), 抑制CyclinB1/CDK1的活性, 从而阻断细胞进入减数分裂, 使细胞停滞在G2时相。也有人认为P53参与G2期的维持, 并不参与G2期的启动, 所以非G2期阻滞所必须的。Matsui F等用大剂量射线照射鼠胚胎纤维母细胞, 发现野生型P53细胞中P53的表达明显高于P53突变的细胞, 但两者的G2期阻滞效应却无明显不同, 似乎表明P5可能不参与G2期阻滞^[7], 因此有学者认为可能与辐射的剂量、条件、损伤程度和细胞种类的不同有关。P53非依赖型主要指CHK1/CHK2依赖的信号转导途径, CHK1是DNA损伤后被激活的一个检查点激酶。在栗酒裂植的酵母细胞周期调控中, 磷酸脂酶Dis2可使活化的CHK1去磷酸化, 使CHK1失活, 解除G2/M检测点阻滞, 恢复细胞周期的进程^[8]。另外一项研究发现CHK1-/-的DT40细胞(鸡的B细胞淋巴瘤)出现自发性凋亡增强, 使细胞增殖缓慢, 且对DNA损伤剂的敏感性增强。将外源性的CHK1基因转染CHK1-/-的细胞, 经电离辐射处理后, 出现细胞周期的阻滞, 细胞存活率和增殖活性增加^[9]。也有研究表明通过反义RNA阻碍CHK1的表达, 会阻断DNA损伤引起G2期的阻滞, 同时细胞凋亡增加^[10]。CDK2是Rad53及cds1的同源基因, 作为另外一种被DNA损伤激活的检查点, 也参与细胞周期的调控。Atsushi H等^[11]用基因打靶技术得到CHK2-/-的鼠胚胎干细胞, 发现X射线照射后并不诱导细胞产生的G2期阻滞。电离辐射损伤后引起的G2期阻滞的信号转导通路间并非完全独立的, 之间存在一定的相互作用。LeeS L等^[12]发现DNA损伤后, CHK1第345位丝氨酸的磷酸化有助于CHK1与P53、P21、14-3-3sigma的结合, 提示CHK1与P53下游的效应分子间存在相互作用。两条途径间存在一个复杂的调控网络。

周期检测点的功能缺陷对引发检测点缺陷反应的射线极为敏感。离体培养的细胞实验也表明处于不同周期时相的细胞敏感性是不同的, 总的倾向是处于G2期的细胞是放射最敏感的, G1期早期相对敏感, 因此寻找靶向破坏细胞周期点的方法, 干扰肿瘤细胞的自我修复, 促进肿瘤细胞的分化和调亡, 是目前放射治疗的研究热点。近年来大量的研究显示, 许多抗癌药物会破坏G2期检测点从而导致肿瘤细胞死亡。在人类所有肿瘤细胞中, 50%-60%存在P53基因突变或功能缺失, 而人体正常组织细胞则无P53基因突变。P53功能缺失的的细胞在DNA受损后, 无法启动G1期的关卡作用, 这时G2期关卡成为受损细胞有丝分裂前进行DNA修复最重要的保护机制, G2期的阻滞对于这类细胞的存活至关重要^[13]。咖啡因(caffeine)是一种通过Cdc25C磷酸化酶来激活Cdc2的化合物, 与射线同时处理细胞后, 会导致G2期检测点功能缺陷而引起凋亡。有研究表明, 咖啡因、UCN-01可以抑制CHK1的活性而解除G2/M期的阻滞^[14]。李晔雄等研究显示己酮可可碱可以增强(E)-(2)-脱氧-氟亚甲基胞苷的放射增敏作用, 其可能的机制和G2周期阻滞相关^[15]。Playle等采用5种不同的P53功能缺失的人结肠癌细胞系进行实验, 放射引起的5种细胞的G2期阻滞均被UCN-01有效去除, 但仅最终2个细胞系显示出放射增敏作用, 因此UCN-01对肿瘤细胞的放射增敏作用可能还存在其他机制^[16]。研究射线对于G1-S期及G2期检测点及相应肿瘤细胞的调亡对于进一步寻找有效增强射线对于肿瘤细胞的杀伤作用的方法有重要意义。