心肌细胞被认为是分化终末期细胞, 根据放射生物学理论, 对射线敏感性较低^{[1, 2]}。在放射性心脏病机理的研究中, 倾向认为毛细血管内皮细胞是射线损伤的靶细胞, 心肌细胞的变性及心肌纤维化是继发于内皮细胞受损后心脏微循环障碍所致^[2~4]。γ射线是临床上肿瘤放射治疗的常用射线之一, 目前对于射线照射对心肌细胞的直接损伤的研究还较少。本研究用不同剂量的⁶⁰Co γ射线单剂量照射体外培养的心肌细胞, 观察⁶⁰Co γ射线对心肌细胞活性及凋亡的直接作用。

1 材料与方法 1.1 材料

新生24h内的Wistar大鼠乳鼠购自军事医学科学院实验动物中心。DMEM培养基为美国Sigma公司产品。胰蛋白酶为美国Amresco公司产品。胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术公司, Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。其他试剂为北京化学试剂公司产品。

1.2 方法 1.2.1 心肌细胞培养

取新生24h内的Wistar大鼠乳鼠20只, 无菌条件下剪取心脏, 仔细剥离心房及大血管组织, 然后于预冷的PBS液中漂洗3次。用眼科小剪将组织剪成约0.5mm³碎块, 加入5倍体积的的0.125%胰蛋白酶溶液, 反复吹打消化3~5min, 静置, 待自然沉淀后弃去上清液。剩余沉淀再加入约5倍体积的的0.125%胰蛋白酶溶液, 反复吹打消化3~5min, 静置, 取上清液, 加入含20%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化。剩余沉淀用同样条件及方法继续消化, 一般经3~4次消化即可将组织消化完毕。收集各次消化产物, 离心, 去上清, 沉淀重悬于含20%胎牛血清的DMEM培养液中, 接种于75cm培养瓶, 37℃、5% CO₂培养箱中培养1h, 轻轻吸出细胞悬液, 以5×10⁵/ml的密度接种于35mm培养皿及96孔培养板, 在37℃、5% CO₂培养箱中培养72h后, 用⁶⁰Co γ射线照射。

1.2.2 实验分组

未照射组(A组)、5Gy照射组(B组)、10Gy照射组(C组)、20Gy照射组(D组)。

1.2.3 ⁶⁰Co γ射线照射参数

剂量5Gy, 10Gy, 20Gy, 照射率510.4cGy/min距离2.5m。

1.2.4 乳酸脱氢酶(LDH)检测

用24孔培养板培养心肌细胞, 照射后48h, 吸取细胞培养上清, 用日立7600全自动生化分析仪, 采用IFCC推荐的方法检测培养液中LDH浓度。

1.2.5 MTT实验

用96孔板培养细胞, 分别于照射后48h、120h后加入MTT(终浓度0.5mg/ml), 37℃、5% CO₂培养箱中培养4h, 加入DMSO100μl, 震荡5min, 酶联仪(购自BIO-RAD公司)570nm处测OD值。

1.2.6 结晶紫实验

用96孔板培养细胞, 分别于照射后48h、120h后行结晶紫实验, 吸去各孔中培养液, PBS洗2次; 1%戊二醛固定, 15min; 用蒸馏水冲洗, 甩净干燥后加结晶紫, 30min; 弃染色液, 蒸馏水冲洗, 晾干后加1%曲拉通, 振荡5min, 酶联仪(购自BIO-RAD公司)570nm处测OD值。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(购自北京宝赛生物技术有限公司), 操作步骤按试剂盒说明进行。用胰酶消化细胞, 调整待测细胞的浓度为5×10⁵~1×10⁶个/ml。取1ml细胞, 1000rpm, 4℃离心10min, 弃上清。加入1ml冷的PBS, 轻轻震荡使细胞悬浮。1000rpm, 4℃离心10min, 弃上清。重复洗涤两次。将细胞重悬于200μl Binding Buffer。加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI, 轻轻混匀, 避光室温反应15min或4℃反应30min。加入300μl Binding Buffer, 在1h内上机检测。检测结果判断:Annexin V-FITC^-、PI^-为正常活细胞, Annexin V-FITC⁺、PI^-为凋亡细胞, Annexin V-FITC⁺、PI⁺为坏死细胞。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS10.0统计软件, 两组间比较采用t检验, 多组间比较采用方差分析。

2 结果 2.1 培养液中LDH浓度

照射组(B、C、D组)的LDH浓度均明显高于照射组(A组)(P < 0.05或 < 0.01), 且随照射剂量增高, LDH浓度增高(图 1)。

2.2 结晶紫法检测结果

分别在照射后48h、120h用结晶紫染色法检测活细胞数, 照射后48h未照射组和各照射组吸光度值(OD)差异无显著性(P>0.05), 照射后120h照射组与未照射组OD值差异有显著性(P < 0.05或 < 0.01), 细胞活性降低与照射剂量间呈量效关系(图 2)。

2.3 MTT法检测结果

分别在照射后48h、120h用结晶紫染色法检测活细胞数, 得到的结果与结晶紫法相似, 照射后48h未照射组和各照射组光密度值(OD)差异无显著性(P>0.05), 照射后120h照射组与未照射组OD值差异有显著性(P < 0.05或 < 0.01), 细胞活性降低与照射剂量呈正相关(图 3)。

2.4 细胞凋亡检测

心肌细胞照射后48h流式细胞仪细胞凋亡, 显示随照射剂量增加, 细胞凋亡增多.统计学分析结果显示照射组(B、C、D)细胞凋亡率较未照射组(A组)细胞凋亡率均增高(P < 0.01或P < 0.05)(见图 4)。

3 讨论

根据放射生物学的理论, 在接受辐射后, 分裂期细胞的放射损伤明显.心肌细胞属于不分裂细胞(postmitotic), 射线对其的直接损伤作用不明显^[2].在放射性心脏病机理的研究中, 倾向认为毛细血管内皮细胞是射线损伤的靶细胞, 心肌细胞的变性及心肌纤维化是继发于内皮细胞受损后心脏微循环障碍所致^[2~5], 目前对于γ射线照射对心肌细胞的直接损伤及防治还鲜见报道。在本研究中, 用胰蛋白酶消化分离新生大鼠心脏获得体外培养心肌细胞的模型是稳定可靠的, 细胞存活率及纯度均可达95%以上^[6]。体外培养72h后, 分别用⁶⁰Co γ射线5Gy、10Gy、20Gy单剂量照射体外培养的心肌细胞, 然后分别检测培养液中LDH浓度、结晶紫染色、MTT法和Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒等方法观察心肌细胞的损伤、细胞活性及细胞凋亡比率变化。

LDH系胞质酶, 正常情况下不能透过细胞膜, 但当细胞受到损伤时, 细胞膜通透性增强, LDH会从细胞质内漏出, 细胞质内LDH减少, 培养液中LDH增多, 测定培养液中LDH浓度可反映心肌细胞的损伤情况。结晶紫实验的原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收, 死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料, 而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取, 通过测定提取液的光密度值(OD), 就可测定活细胞的数量^[7]。MTT法亦可通过所测细胞的OD值不同反映活细胞数的变化。本研究中, 照射后48h流式细胞仪检测细胞凋亡, 结果显示不同剂量的⁶⁰Co γ射线照射均可促进细胞凋亡, 而且随着照射剂量的增加, 细胞凋亡增加。照射后48h的心肌细胞的培养上清中的LDH浓度较未照射组明显升高, 与照射剂量呈量效关系, 说明⁶⁰Co γ射线照射可对心肌细胞造成一定程度的损伤。结晶紫染色与MTT法得到的结果相类似, 照射后48h各组细胞OD值间无明显差异, 照射后120h照射组细胞的OD较为照射组明显降低, 与照射剂量相关, 亦说明⁶⁰Co γ射线对体外培养的心肌细胞有毒性作用, 照射后48h各组间OD值无明显差异考虑与在细胞的损伤早期结晶紫染色及MTT法不够敏感有关, 在照射后48h时细胞活性下降, 早期凋亡细胞增多, 但仍可摄取结晶紫及MTT, 故各组细胞所测OD值差异不明显, 在照射后120h, 细胞功能进一步受损, 结晶紫及MTT摄取能力下降, 导致OD值较为照射组明显下降。

上述结果均提示⁶⁰Co γ射线照射体外培养的心肌细胞对其有直接损伤作用, 降低细胞活性, 促进凋亡细胞。根据放射生物学的理论, 心肌细胞属于终末分化细胞, 对辐射敏感性较低。本研究的实验结果则提示⁶⁰Co γ射线照射可直接损伤体外培养的心肌细胞, 促进细胞凋亡。体外培养的心肌细胞的放射损伤机理目前尚不明确。有报道心肌细胞放射损伤可致线粒体结构破坏, 功能受损, 导致能量代谢障碍^[8]。在本研究中发现, 照射后各组细胞的细胞周期未见明显差异, 照射后48h细胞心肌细胞凋亡率增加, 在照射后12h, 心肌细胞内质网和线粒体明显损伤(结果未在该文中显示), 由此考虑, 照射后线粒体及其他细胞器功能障碍受导致细胞功能障碍, 细胞活力下降, 细胞凋亡增多, 但γ射线致心肌细胞损伤的机理仍需进一步研究。