恶性肿瘤放射治疗中乏氧细胞的存在是使放疗失败或肿瘤复发的主要原因之一, 寻找高效低毒的肿瘤放疗增敏剂是当前放疗急需解决的课题。中国医学科学院放射医学研究所药物室合成的新药9401号(N-烟酰基亚氨基二乙酸)是一种烟酰氨基酸类化合物, 初步实验已显示其增敏效果比母体化合物烟酰胺要好, 对正常细胞毒性也比烟酰胺低。为进一步证实9401号的放射增敏效果, 为临床使用9401号作为放射增敏剂提供理论依据, 我们采用细胞克隆形成法, 研究其对离体Hela细胞的细胞毒性和体外放射增敏作用。

1 材料与方法 1.1 药物

9401号药由中国医学科学院放射医学研究所药物室首次合成, 白色粉状晶体, 含量大于99 %, 熔点182 ~ 191 ℃, 分子量133.11。用蒸馏水和少量NaOH溶解后配成100 mg ml原液, 超滤除菌后使用。

1.2 细胞培养

Hela细胞由天津医科大学生命中心教研室提供, 培养于37 ℃, 5%CO₂孵箱中。用含有10%小牛血清的RPMI Medium 1640培养, 细胞每3 ~ 4d传代一次。

1.3 照射方式

采用¹³⁷ Csγ射线(Cammacell 40加拿大产)为照射源, 剂量率0.8077 Gy min, 根据实验要求进行不同剂量的照射。

1.4 9401号药物毒性测定

取指数生长期的Hela细胞, 胰酶消化计数, 在25 ml培养瓶中加培养基5 ml, 每瓶分别接种600个细胞, 贴壁培养24 h后, 加入不同浓度的9401号药, 每种浓度设3个平行样。药物作用3 h后, 立即除去药物, 用培养基洗涤细胞两次, 重新加入不含药物的新鲜培养基5 ml, 于培养箱中培养7 d。甲醇固定, Giemsa染色后计数细胞集落数, 计算出集落形成率。实验重复两次, 取两次平均值, 以9401号药浓度为横坐标, 存活分数为纵坐标, 绘制药物浓度-效应曲线, 推算出9401号药的半数抑制剂量(ID₅₀)。

1.5 9401号药对Hela细胞放射敏感性的影响

用3 mg ml的9401号药作放射增敏研究。取指数生长期的Hela细胞, 胰酶消化计数, 稀释后将细胞接种于25 ml培养瓶, 贴壁培养24 h后, 单纯照射组不加药, 用药组加入150 ul的9401号药, 分别在3, 6, 12, 24 h后除去药物。除去24 h组药后几组一起照射。单纯照射组和药物加照射组分别照射0, 1, 3, 5, 7 Gy。照射后在37 ℃, 5 %CO₂培养箱内继续培养6 d, 甲醇固定, Giemsa染色, 计数细胞集落数(计数≥50个细胞的集落), 计算细胞存活分数(SF)。存活率(SF)=实验组细胞集落数(细胞种植数×贴壁率)

1.6 统计学处理

实验重复2次, 每次设3个平行样, 结果取平均值。实验数据用origin软件按常用的几种模型进行曲线拟合分析, 经残差平方和计算后, 认为本实验以“单击多靶模型”较合适, 即选用SF =1-(1-e^-D/D_o) ^N进行曲线拟合分析。

2 结果 2.1 9401号对Hela细胞的药物毒性

9401号对Hela细胞有较强的药物毒性, 随着药物浓度的增加, 细胞存活分数降低, 其ID₅₀为4.65 mg ml(图 1)。

2.2 9401号对Hela细胞的放射增敏作用

用3 mg ml的9401号分别作用不同时间, 各组细胞存活曲线如图 2, 放射增敏比SERDo与药物作用时间的相互关系如图 3。以Do, Dq值和临床常用照射剂量2 Gy的存活分数为标准计算放射增敏比, SERDo, SER Dq和SERSF2随9401号药作用时间的增加而增加(表 1)。

3 讨论

实验证明: 9401号对Hela细胞具有放射增敏效应并呈时间依赖性。平均致死剂量(D₀)是细胞存活曲线直线部分杀死63 %细胞所需的剂量, 它反映不同细胞的放射敏感性, 或同一种细胞放射敏感性的变化^[1]。表 1中D₀值随药物作用时间增加而变小表明, 随着作用时间增加, 9401号增加了Hela细胞对射线的敏感性。准域剂量(Dq)是由曲线的直线部分向上延伸, 与存活率为1.0处横轴的平行线相交处所示剂量, 它反映曲线的肩区大小, 表示细胞的亚致死损伤修复能力。加入9401号药后Dq值变小说明Hela细胞修复亚致死损伤的能力变弱, 这对常规分次照射可能会显示更大的增敏效果。随着9401号作用时间的延长, 照射组SER_Do, SER_Dq, SER_SF2值均增加, 这表明9401号对Hela细胞的放射增敏作用具有时间依赖性。9401号药的初步实验表明:其作用机制类似烟酰胺, 但放射增敏效果比烟酰胺好。9401号的母体化合物烟酰胺是烟酸(维生素B₃)的酰胺衍生物, 是一种低毒的放射增敏剂, 其作用机制是通过增加血流灌注, 增加乏氧肿瘤细胞的氧合作用和乏氧肿瘤组织氧分压而引起肿瘤放疗增敏作用的^{[2, 3]}。目前国外己对其进行了二期临床试用, 作为头颈部癌和膀胱癌放疗增敏剂, 结果发现有很高的肿瘤局部控制率^{[4, 5]}。初步体外实验已证明: 9401号药对L1210细胞辐射增敏比(SER)为1.56, 而烟酰胺为1.05;对KB细胞(人鼻咽癌细胞株)辐射增敏比(SER)为1.41, 而烟酰胺为1.03。

9401号药作为一种新的肿瘤放疗增敏药, 增敏效果好, 同时具有肿瘤细胞毒性, 具有相当广阔的临床应用前景。