电离辐射通过对生物大分子的直接作用和间接作用导致各种类型的DNA损伤。在DNA的各种损伤中, DNA双链断裂又被公认为是电离辐射致畸、诱变和导致细胞死亡的主要损伤因素。研究DNA双链断裂及修复对于生物体有重要意义。对DNA双链断裂及修复的研究得到科学界的很大关注, 各种检测DNA双链断裂的技术被应用在电离辐射所致的DNA双链断裂中, 笔者就几种常用于检测电离辐射导致的DNA双链断裂的技术进行简要综述, 并介绍最近应用在电离辐射导致DNA双链断裂的快速敏感检测方法———γ-H2AX分析技术。
1 检测电离辐射所致DNA双链断裂损伤的传统方法传统的中性蔗糖沉降技术及中性滤膜洗脱技术只适用于小分子DNA以及低敏感性的细胞DNA损伤的检测[1], 但是检测的结果稳定性差, 灵敏度低; 此外, 该方法的剪切过程在实际运用中会增加双链断裂的数量, 影响实验结果; 并且不适用于检测高剂量(如20Gy)电离辐射导致的DNA大片段的损伤, 在近几年的实验研究中已经逐渐被其他新技术取代。另外, 测定链断裂的蔗糖梯度密度离心法、DNA碱解旋法、DNA粘度测量法是对群体细胞损伤效应的评价而使它们的推广应用受到限制。
2 检测电离辐射所致DNA双链断裂损伤的方法 2.1 脉冲电场凝胶电泳法(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)脉冲电场凝胶电泳实验是采用两个交变电场, 即两个电场交替的开启和关闭, 使DNA分子电泳的方向随电场的变化而改变, 从而使大分子DNA得以分离[2]。目前脉冲电场凝胶电泳实验以多种形式得到广泛应用, 该方法通过间接检测DNA双链断裂及修复, 在探讨辐射诱变的DNA损伤和修复中拥有很大的应用潜力[3], 被国外学者在检测小于10Gy的照射所致的DNA双链断裂损伤方面广泛应用。但要想得到DNA双链断裂的绝对值则需要完全分离所有DNA片段, 所以该方法不能用来研究哺乳动物细胞受照后DNA损伤的修复。PFGE技术的优势在于它克服了中性洗脱法的困难, 而且可得到稳定的测定结果; 对分裂期细胞, 泳动的DNA片段可以通过预先标记的3H2dT, 切下待测胶块, 悬浮, 从而计算出DNA的片段; 对于非分裂期的细胞, 则可以通过扫描荧光计来定量计算DNA片段。总的来说, PFGE技术比中性过滤洗脱更灵敏(可达1Gy), 还能提供DNA片段进入胶板后其大小的有关信息, 当然这些要取决于所选择的PFGE系统及电泳条件[3]。早期因其设备昂贵, 操作复杂, 电泳时间较长, 在国内难以得到广泛使用[4]; 但是经过研究者的不断改进, 出现了多种新兴、改进后的检测方法, 使得脉冲场凝胶电泳及其各种衍生技术在生化及遗传学研究方面有着广阔的应用前景, 目前被公认为是检测电离辐射所致DNA双链断裂及修复的敏感方法。
2.2 单细胞凝胶电泳法(single cell gel electrophoresis assay, SCGE)由于采用如洗脱法、沉降法和脉冲电场凝胶电泳(PFGE)等方法和技术, 在分析时需要细胞的数量及取样和测定时间等方面的因素的限制, 所以这些方法很难用于临床活组织标本检测。而单细胞凝胶电泳实验近几年在这方面就得到了广泛的应用。
单细胞凝胶电泳实验又称彗星试验(comet assay), 该方法敏感、快速、简便、重复性好, 无须放射性示踪, 并且可以直接观察单个细胞DNA损伤, 在检测诱变剂、射线等对DNA损伤、监测环境污染物对机体的遗传损伤、研究毒物致癌机制等方面有着广泛的应用价值, 从而成为近年来发展起来并流行的DNA损伤检测的新技术。在电离辐射所致的DNA双链断裂的检测中采用的是中性单细胞凝胶电泳实验[5~10]。
细胞DNA链断裂时, DNA的超螺旋结构遭到破环, 在细胞裂解液作用下, 细胞膜、核膜及其他生物膜等结构受到破坏, 细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分扩散到裂解液中; 而核DNA由于分子量太大, 仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上, 只能留在原位。在中性(pH=8)条件下, DNA链仍然保持双螺旋结构, 偶有的单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时, 才使DNA断片进入凝胶中迁移。电泳时, 带负电荷的DNA移向正极, 形成“彗星”状影像, DNA损伤越多, 进入尾部的DNA碎片越多。尾矩尾部DNA百分数×尾长(μm)]与辐射剂量呈线性相关, 成为较为精确地测定DNA损伤的分析指标。[3, 6, 7, 11]
用中性单细胞凝胶电泳实验检测电离辐射所致的双链断裂损伤, 可探讨辐射致突变、致癌和致死效应的机理。目前该技术已成功地应用于放疗病人的疗效评价、紫外线及电离辐射等因素所致细胞DNA损伤等方面的检测。
2.3 检测电离辐射所致DNA双链断裂损伤的其他方法被用在检测电离辐射所致DNA双链断裂上的方法除上述两种常用的检测方法外, 还有琼脂糖凝胶电泳法[4]、高效毛细管电泳法[12, 13]、碱性微胶电泳法[14]、序列凝胶电泳法[15]、荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)[16~20]、高效液相色谱法[21]、DNA印迹[22]等, 由于篇幅所限, 在此不赘述。
3 检测电离辐射所致DNA双链断裂损伤及修复的快速敏感新方法-γ-H2AX分析技术由H2AX基因指导合成的H2AX蛋白是真核细胞中H2A组蛋白家族中的成员, 属于一类已知的组蛋白分子, 与细胞内的DNA包壳有关。组蛋白分子通常能够在靠近氨基末端或羧基末端的特定丝氨酸或赖氨酸残基上被磷酸化或乙酰化。H2AX编码基因位于11q23.2-q23.3。哺乳动物的H2AX在羧基末端因为包括一个139位为丝氨酸残基的丝氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸(Ser-Gln-Glu, SQE)结构域[23, 24], 所以它能够为磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-OH-kinase-related, PI3K)激酶家族包括毛细血管共济失调突变基因(ataxia telangiectasia-mutated, ATM)蛋白激酶、ATM和Rad3相关蛋白(ataxia-telangiectasia-Rad3-related, ATR)激酶及DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK)等提供磷酸化场所[25]。
3.1 γ-H2AX技术的原理γ-H2AX技术是通过抗体标记细胞核内的γ-H2AX, 通过对γ-H2AX的直观计数来检测双链断裂损伤及修复情况的一种方法。实验研究中, 可采用免疫荧光技术或是Western blotting实验路线, 根据研究者的需要, 应用γ-H2AX多克隆抗体或单克隆抗体作为一抗, 结合相应的荧光标记的二抗, 通过染色可以清楚地观察到γ-H2AX以及染色质中包含双链断裂的区域。
实验还发现, 采用免疫荧光技术观察γ-H2AX, 其产生数量与双链断裂的数量相对应[26, 27]。而且该技术还可通过观察γ-H2AX数量的减少情况来检测双链断裂损伤的修复情况。目前, γ-H2AX已经成为检测细胞受电离辐射后所导致的双链断裂数量及损伤修复情况的可靠指标[27]。
3.2 γ-H2AX分析技术在研究电离辐射所致DNA双链断裂中的应用前景以前检测DNA双链断裂的许多方法大多局限在它们对检测双链断裂的敏感性上, 即只能对双链断裂与否做出判断; 而用免疫荧光方法检测γ-H2AX即γ-H2AX分析技术, 不仅能够判断双链断裂与否, 还可以测定双链断裂的数量并且能够将双链断裂的修复情况量化[27]。而且, 即使是低剂量(1mGy)辐射引起的双链断裂损伤及修复也能用该方法进行分析。虽然脉冲电场凝胶电泳实验(PFGE)替代了以前检测双链断裂的方法, 被公认为是对双链断裂的较为敏感的测量方法; 但是, 在检测双链断裂, 尤其是对低剂量辐射所致的双链断裂的检测上, γ-H2AX分析技术比脉冲电场凝胶电泳实验更敏感, 这使γ-H2AX分析技术具有直接作为人群接受低剂量电离辐射生物指标(biomarker)的潜力[27]。
另外在不能直接测量电离辐射或其他致癌因素所致的DNA双链断裂的情况下, 用γ-H2AX分析技术可以对DNA的损伤进行检测, 从而估算出导致双链断裂的物理或化学因素的剂量, 从而更好地指导人们制定辐射干预措施, 进行有效的辐射防护。
同时, 该技术还可以用于控制接受职业性或诊断性电离辐射的剂量[27], 并将在癌症治疗的放疗过程中发挥其独特的作用[28], 使人们得到更有效的诊断治疗和辐射防护。随着γ- H2AX技术的进一步完善, 它将被广泛应用于电离辐射尤其是低剂量辐射导致的DNA双链断裂中, 从而更好地探索低剂量电离辐射的辐射效应机制。
4 结束语随着分子辐射生物学学科的发展, 辐射诱发DNA的损伤与修复、DNA双链断裂与辐射致突、致癌分子机理的研究得到不断深入, 检测DNA双链断裂与修复的方法和手段也随之得以发展与完善, 并且新的检测手段和方法也不断被引入, 研究者可以根据各种检测方法自身的优势和适用范围选择合适的检测双链断裂的方法, 对电离辐射导致的DNA双链断裂及修复进行更好的研究。
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