急性白血病的异基因骨髓移植(ALLo -BMT)中, 移植物抗宿主病(GVHD)成为移植死亡的主要原因之一^{[1, 2]}。在其机理的研究方面已获得较肯定结果, 主要与供者的T细胞有关^[3]。

活化T细胞经过释放多种淋巴细胞因子, 引起组织损伤。但是, 有关GVHD发生的机制中, 探讨GVHD反应过程中肺部巨噬细胞分泌细胞因子的变化具有重要意义的报道较少。本研究在建立异基因骨髓移植GVHD模型基础上, 检测肺泡巨噬细胞分泌细胞因子水平变化, 以及是否参与GVHD过程。

1 材料与方法 1.1 实验动物

C57BL/6小鼠(H-2b), 18 ~ 20 g, 雄性, 40只, 中国科学院实验动物中心提供。BALB/C小鼠(H -2d), 18 ~ 20g, 雌性, 40只, 中国科学院实验动物中心提供。

1.2 骨髓移植方法

① 辐射小鼠:按剂量率11.6CGy, 总剂量8.12Gy, 进行C57BL/6受体小鼠⁶⁰Co照射。②供体骨髓单个核细胞数制备:无菌条件下采集BALA/C小鼠股骨, 按200目筛网研磨成单个细胞悬液, 调细胞数2 ×10⁷/ml。脾脏经剪切成小组织块后, 同法研磨成单个细胞, 以Ficoll分离单个核细胞, 调至2 ×10⁷/ml。③GVHD试验:取供体BALB/C鼠骨髓细胞(1 × 10⁷)与脾脏细胞(5×10⁶)混合液, 经尾静脉注入受体C57BL/C辐射小鼠, 作为GVHD组。同时取C57BL/6小鼠骨髓细胞(1 × 10⁷), 经尾静脉注入辐射后C57BL/6小鼠体内, 作为同基因骨髓细胞移植组。

1.3 造血功能指标测定

① 外周血白细胞计数。按本室常规进行。②骨髓CFU-GM测定。按本室以往报道的半固体琼脂培养方法进行。

1.4 观测指标

① GVHD试验:一般状况(活动、饮食、皮毛、体位); GVHD反应(大小便、脱毛、体位改变); 外周血白细胞; 病理学检查(肝、脾、小肠及皮肤); 30d死亡率观察。

1.5 肺巨噬细胞分离

肺泡巨噬细胞采用传统支气管肺泡冲洗法, 以106巨噬细胞/ml培养0、1、3、5、7d(37 ℃, 5 %CO₂, 饱和湿度), 收集培养上清液, 1 000 g/min离心5 min。

1.6 上清液IL-1β和TNFα ELISA测定

细胞培养上清中IL-1β ELISA试剂盒来自Endogn INC (Bosten, MC, USA).TNFα和G -CSF ELISA试剂盒来自PHAMAGIN Co.所用试剂已经证实无交叉反应。IL-1β的敏感度为2 pg/ml, TNFα敏感度为4pg/ml。

1.7 统计学方法

结果表示为均数±标准差, 采用T test进行统计学分析。

2 结果 2.1 GVHD反应

① 一般状况:异基因骨髓移植组出现典型的GVHD反应, 如脱毛, 弓背体位及大小便次数增多等。②体内混合淋巴细胞培养:单纯骨髓细胞移植、异基因骨髓移植¹²⁵I-UdR摄取率(cpm/min)分别为476.6±81.4和785.6 ±98.7。单纯骨髓细胞移植BMT的¹²⁵I-UdR摄取率明显低于异基因BMT组的(P < 0.05)。③病理学改变:异基因组反应符合Ⅱ~ Ⅲ级。④造血功能恢复的观察:外周血白细胞及骨髓CFU -GM的变化详见表 1。同基因BMT组外周血白细胞及骨髓CFU -GM数高于异基因BMT组。30 d死亡率结果表现为, 异基因BMT组30d死亡率为100%(20/20), 同基因BMT组为15%(3/20), 两组差别明显(P < 0.05)。

经统计学处理, 第6天时, 两实验组WBC或GM -CFUc无明显差别(P >0.05), 但均低于正常对照。移植后第12天时, 异基因组WBC偏低, 与同基因组组比较, 其差别明显(P > 0.05)。第18天时, 各组WBC均明显升高。但是, 异基因组WBC和GM-CFUc低于同基因组(P < 0.05)。

2.2 GVHD反应前后肺泡巨噬细胞细胞因子分泌变化

表 2显示, 肺部巨噬细胞分泌细胞因子呈现短暂降低, 继而分泌升高, 与GVHD反应程度相关。

3 讨论

近年来, 急性白血病的异基因骨髓移植(ALLo -BMT)的研究与应用有了较大进展。然而, 主要组织相容性抗原复合物屏障的存在, 使移植物抗宿主病(GVHD)成为移植死亡的主要原因之一^{[1, 2]}。在其机理的研究方面已获得较肯定结果, 主要与供者的T细胞有关^[3]。即骨髓移植后, 供者T细胞识别受者主要组织相容性抗原系统, 从而激活细胞毒T细胞。活化T细胞又释放多种淋巴细胞因子, 引起组织损伤。所以减少GVHD是保证移植成功的关键之一。

但是, 有关GVHD发生的机制比较复杂, 可以涉及多种器官与组织的参与, 并往往与细胞因子的变化有关。而肺部巨噬细胞可以释放多种细胞因子, 其分泌水平的变化一定程度上与体内细胞因子的消长一致^{[4, 5]}。因此, 探讨GVHD反应过程中肺部巨噬细胞分泌细胞因子的变化具有重要意义。研究结果表明小鼠异基因骨髓移植后表现典型GVHD反应, 肺部巨噬细胞分泌细胞因子呈现短暂降低, 继而分泌升高的变化特点。表明异基因骨髓移植时肺泡巨噬细胞分泌细胞因子水平与GVHD反应有关。