微波辐射属非电离辐射, 不仅可干扰和破坏电子通讯设备, 亦可对生物体造成伤害, 因此微波辐射已成为一种新的环境污染而受关注。神经系统作为微波辐射最为敏感的靶部位之一尤受重视。脑赖以产生能量的底物较其他组织少, 储存的能量也很少, 但其功能复杂, 代谢十分旺盛^[1]。研究表明, 微波辐射可引起机体能量代谢异常^[2], 而高功率微波(high power microwave, HPM)的损伤效应报道较少。本实验旨在探讨高功率微波辐射大鼠后脑能量代谢的变化, 为阐明其损伤效应及深入探讨其机制奠定基础。

1 材料和方法 1.1 实验动物分组及辐射方法

120只二级雄性Wistar大鼠, 体重(180±20) g, 由军事医学科学院实验动物中心提供, 随机分为假射组(20只)和3、10、30和100mW/cm²辐射组, 各25只。辐照方式采用脉冲微波源, 辐照时动物置于布满吸收材料的微波室内, 大鼠置于有机玻璃盒内, 照射时间为5 min。

1.2 光镜标本

实验动物分别于辐射后6 h, 1, 3, 7和14d活杀取大脑皮层、海马和丘脑, 一半用10%缓冲福尔马林固定, 石蜡包埋, 甲苯胺蓝染色^[3], 观察神经元胞浆中尼氏体变化; 另一半4 %多聚甲醛固定, 30%蔗糖脱水, 制作冰冻切片, 采用Wachstein-Meisel镁激活酶法行ATP酶染色, Nachlas硝基四唑蓝法行SDH染色^[3]。

1.3 电镜标本

取上述6h时间点大脑皮层组织和海马1mm³, 立即放入2.5%戊二醛和1%锇酸固定, 制作超薄切片, 醋酸铀和柠檬酸铅双重染色^[4], 透射电镜观察大脑皮层和海马超微结构改变。

1.4 图像分析及定量方法

在光镜10 ×40倍视野下, 应用CMIAS-Ⅱ图像分析仪对尼氏体、ATP酶和SDH染色结果进行积分光密度(IOD)和平均光密度(MOD)测定, 每组切片随机选取10个视野。

1.5 统计学处理

文中数据用均数和标准差(x ±s)表示, 采用Origin 7.0软件t检验进行分析。

2 结果 2.1 HPM辐射后不同脑区神经元尼氏体变化 2.1.1 大脑皮层神经元尼氏体改变

3 mW/cm²组仅在辐射后6 h神经元内尼氏体有所减少(P < 0.01), 1 d时已恢复正常; 10 mW/cm²和30 mW/cm²组在辐射后1 d时神经元内尼氏体明显减少(P < 0.01), 3 d时见恢复; 100 mW/cm²组在辐射后6 h时即见尼氏体明显减少(P < 0.01), 14 d时仍未恢复。表明HPM辐射后大脑皮层神经元尼氏体减少, 但恢复也较快。定量分析结果见表 1。

2.1.2 海马神经元尼氏体改变

3 mW/cm²组在辐射后6 h神经元尼氏体减少(P < 0.01), 1 d时基本恢复; 10 mW/cm²组在辐射后1 d内神经元尼氏体明显减少(P < 0.01), 3 d时可见恢复; 30 mW/cm²组在辐射后3 d内神经元中尼氏体明显减少(P < 0.01); 100 mW/cm²组在辐射后6 h时见神经元尼氏体明显减少(P < 0.01), 14 d时有所恢复。表明HPM辐射后海马神经元中尼氏体明显减少。定量分析结果见表 2。

2.1.3 丘脑神经元尼氏体改变

3 mW/cm²组和30 mW/cm²组在辐射后3 d时丘脑神经元尼氏体明显减少(P < 0.01); 10 mW/cm²组在辐射后6h时神经元尼氏体明显减少(P < 0.01), 1d后逐渐恢复; 100 mW/cm²组辐射后3 d内神经元尼氏体明显减少(P < 0.01), 14 d时见恢复。表明HPM辐射后丘脑神经元内尼氏体明显减少。定量分析结果见表 3。

2.2 HPM辐射后大脑皮层ATP酶和SDH含量变化 2.2.1 大脑皮层ATP酶含量改变

3mW/cm²组在辐射后1d内ATP酶含量显著升高(P < 0.01), 3 d时基本恢复; 10 mW/cm²组在辐射后3 d内其含量显著升高(P < 0.01), 14 d时基本恢复; 30mW/cm²和100mW/cm²组在辐射后3d内其含量显著升高(P < 0.01), 7d时基本恢复, 但100mW/cm²组在辐射后14d时ATP酶含量又显著升高(P < 0.01)。表明HPM辐射后ATP酶含量显著升高。定量分析结果见表 4。

2.2.2 大脑皮层SDH含量改变

3mW/cm²组在辐射后3d内其含量降低(P < 0.01), 但有反复, 7d时基本恢复; 10mW/cm²和100mW/cm²组在辐射后3d内其含量显著降低(P < 0.01), 7d时基本恢复; 30mW/cm²组辐射后1d其含量显著降低(P < 0.01), 7d时基本恢复。表明HPM辐射后SDH含量显著降低。定量分析结果见表 5。

2.3 HPM辐射后大脑皮层和海马超微结构改变

辐射后6h, 各辐射组大脑皮层和海马均可见突触内囊泡堆积或排空, 活性区延长, 突触间隙模糊不清, 突触后致密物增加及突触穿孔; 髓鞘局灶融合、解离; 血管周间隙增宽。且海马神经元见胞浆疏松, 线粒体肿胀, 嵴断裂, 甚至空化, 粗面内质网扩张, 脱颗粒, 核膜间隙增宽, 染色质浓缩、边集; 胶质细胞水肿; 而大脑皮层神经元及胶质细胞改变轻微。可见海马损伤重于皮层, 且各辐射组间损伤无明显差异。

3 讨论

脑赖以产生能量的底物较其他组织少, 储存的能量也较少, 但其功能复杂, 代谢十分旺盛。尼氏体特异性分布于神经元胞体和树突, 其在电镜下是由粗面内质网、游离核糖体和多核糖体构成, 是神经元合成蛋白质最活跃的部位, 尼氏体减少或消失是神经元损伤的表现^[5]。线粒体是细胞有氧氧化合成ATP的部位, 同时也是对一般损伤最敏感的细胞器。线粒体的损伤将影响到神经元的能量代谢, 从而影响到神经元的形态和功能。ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)与细胞能量的产生和利用密切相关。神经元内ATP酶是维持神经元兴奋传导、突触传递和离子内环境稳定的物质基础, 观察ATP酶含量变化有助于揭示神经元损伤机制。脑所需的能量主要靠糖代谢供给, 糖的有氧代谢过程中琥珀酸需在SDH的参与下分解, 分析脑组织中SDH的含量可反应机体内物质氧化、功能代谢状态及线粒体功能。

研究表明, 微波辐射可引起脑能量代谢异常。Albert EN^[6]采用2 450MHz、10mW/cm²微波辐照幼鼠后1d, 光镜发现小脑浦肯野细胞尼氏体完全崩解。电镜下, 浦肯野细胞粗面内质网排列紊乱。另有学者发现HPM辐射大鼠后, 可使海马和下丘脑神经元尼氏体减少, 甚至消失^{[7, 8]}; 但也有学者发现, 20mW/cm²组微波辐照小鼠后, 大脑皮层神经元尼氏体有部分扩大现象^[9]。赵亚丽等用2450MHz微波辐射小鼠, 发现1mW/cm²组大脑皮层、海马和丘脑Ca²⁺、Mg²⁺ -ATP酶活性均增高, 5mW/cm²组均无改变, 但10mW/cm²组皮层、海马Ca²⁺、Mg²⁺ -ATP酶活性下降, 海马神经元电压依赖性Na⁺, K⁺, Ca²⁺离子通道被影响, 而丘脑无改变^{[10, 11]}, 表明微波辐射影响了海马和皮层功能(如学习记忆功能)。也有学者采用3GHz, 8mW/cm²脉冲微波辐照胎鼠和5mW/cm²辐照小鼠后, 发现下丘脑和海马的SDH均显著下降^{[12, 13]}

鉴于HPM辐射对脑代谢的影响报道较少。本研究采用甲苯胺蓝染色方法检测3 ~ 100mW/cm² HPM辐射对大脑皮层、海马和丘脑神经元尼氏体的影响, 发现HPM可引起尼氏体减少甚至消失, 但偶可见尼氏体增加, 可能与机体的适应性反应有关。采用组织化学染色的方法检测3 ~ 100mW/cm² HPM辐射后ATP酶和SDH的含量改变。结果发现, 辐射后3d内, 3mW/cm²、10mW/cm²、30mW/cm²和100mW/cm²组ATP酶含量均明显升高, SDH含量均明显降低。表明脑能量代谢障碍, 由于脑内ATP储备较少, 微波辐射后细胞启动自身调节机制, 能量产生随之增加, 7d时基本恢复正常, 表明机体损伤尚在代偿能力之内。电镜下可见HPM辐射后6h线粒体肿胀, 嵴断裂, 甚至空化; 光镜下神经元的水肿、变性可能和HPM对线粒体和粗面内质网的损伤有关。

综上, 3 ~ 100mW/cm² HPM辐射后ATP酶含量升高, SDH含量降低, 表明HPM辐射后脑糖代谢障碍, ATP酶反应性的升高来对抗这种改变, 直至7d二者基本恢复, 且二者动态变化规律基本一致。此外, 脑细胞能量代谢异常与脑细胞的损伤密切相关, 能量代谢恢复后, 脑损伤也逐渐恢复。HPM辐射后大脑皮层和海马线粒体明显损伤, 是脑代谢障碍的结构基础。HPM辐射后大脑皮层和海马尼氏体减少, 在超微结构可见粗面内质网的损伤, 表明粗面内质网损伤后, 蛋白合成异常, 加重细胞损伤; 反过来细胞损伤持续进展, 又可导致内质网的进一步损伤。