2. 新疆医科大学公共卫生学院;
3. 新疆克拉玛依市中心医院;
4. 北京大学医学部公共卫生学院
美国毒性物质与疾病登记署(ATSDR)和环境保护署(EPA)将镉列为第七位危害人类健康的有毒物质。我国目前至少有16个省(直辖市)、自治区报道过职业或环境镉暴露对健康的不良影响[1]。妊娠过程镉暴露可导致胎盘结构改变、胎盘物质转运功能失调、早产、胎儿发育受损和出生体重下降等。尽管胎盘对镉具有明显的屏障作用, 镉仍可对胎儿造成损害。一方面原因可能是胎儿时期对镉异常敏感, 另一方面可能由于镉对胎盘的结构和功能造成损害而间接影响胎儿。金属硫蛋白(Metallothionein, MT)与环境健康危险因素关系的研究近年来在学术界极为重视, 国内学者曾作过专门的综述[2]。本研究旨在通过光学显微镜观察胎盘组织结构的变化以及应用免疫组织化学的方法检测胎盘组织中MT的表达情况, 比较镉暴露与否对胎盘的组织结构和MT表达的影响, 进而分析胎盘的组织学改变和MT表达的关系, 明确MT在减轻镉对胎儿及新生儿的健康危害中所起的作用。
1 方法 1.1 研究地区湖北省某市有色金属公司冶炼厂建成近40α, 以铜精矿为原料生产粗铜, 排出的污染物以镉为主, 此外还包括铜、锌等, 本调查选择了三个位于冶炼厂周边的地区为研究地区。
1.2 研究对象 1.2.1 纳入标准凡是2002年11月~2003年4月期间20~ 34岁的待产孕妇、单胎妊娠、居住当地15年以上并以当地自产的粮食和蔬菜为主要食品的非流动者可纳入本项研究。
1.2.2 排除标准将具有职业性镉接触史; 发生治疗性引产、死产; 患有慢性肝病、慢性肾病、内分泌疾病等; 近半年服用钙剂、铁剂、维生素D、复合微量元素制剂的孕妇剔除。
1.3 研究措施 1.3.1 问卷调查和体格检查问卷内容包括孕妇的一般情况、疾病史、用药史、生育史、吸烟和饮酒习惯、本次妊娠情况等。体检内容包括常规检查项目和血象常规检测。
1.3.2 样品采集和保存产前一周内采集孕妇空腹静脉血3 ml, 胎儿娩出后取脐血3ml, 分别加入肝素抗凝管, 充分摇匀, -20℃冷冻保存。将胎盘均分为8份, 沿中心对称取其中2份(全厚度), -20℃冷冻保存, 进行元素测定前将胎盘进行冷冻干燥, 研磨成粉末; 另取胎盘2小块(全厚度), 经10%中性福尔马林固定, 用于制备石蜡包埋胎盘组织块。
1.3.3 镉的测定孕妇全血、脐血和胎盘中镉含量的测定均采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。样品采集和测定过程中使用的试剂均为优级纯, 试管等器材用1:1HNO3浸泡过夜后双蒸水冲洗。孕妇全血镉和脐血镉采用国家一级标准参考物质09133、胎盘镉采用国家一级标准参考物质GBW08551进行质量控制, 与样品全过程同步操作。
另外, 抽取10%的样品进行双份平行样测定。孕妇全血、脐带血和胎盘样品中镉含量的平均变异系数分别为8.8%、10. 6%和2.0%。
1.3.4 胎盘常规组织学镜检及MT的免疫组化检测 1.3.4.1 常规HE组织学镜检按常规HE染色进行胎盘病理组织学检查, 观察项目依据《胎盘病理学》附表[3]。
1.3.4.2 MT的免疫组化检测主要试剂:单克隆抗MT抗体(CloneE9, DAKO), SP试剂盒(即用型)、DAB显色试剂盒均购自福建迈新生物技术开发公司(MAIXIN_BIO)。
检测方法:经10%中性福尔马林固定的胎盘组织, 石蜡包埋胎盘组织块制成4μm厚切片, 免疫组化采用S-P法(Streptavidin-Peroxidase, SP), 检测MT的步骤按SP试剂盒说明书, 单克隆抗MT抗体的工作浓度为1:100, 用已知阳性切片作阳性对照, PBS(磷酸缓冲液)代替一抗作为阴性对照。
结果判定:由多名病理医师光镜下观片, 计数阳性细胞。
判定标准:随机选5个高倍视野(400倍), 计数阳性细胞比例(取所有人计数结果的平均值), 以棕黄色作为阳性标准, 参照阳性、阴性对照片, 最后进行综合判断:①按细胞显色有无及深浅记分:0-无色、1-浅棕黄色、2-深棕黄色; ②按显色细胞所占比例记分:0-阳性细胞率为0%、1-阳性细胞率为1~ 5%、2-阳性细胞率为6~25%、3-阳性细胞率为26~50%、4-阳性细胞率为51%~75%、5-阳性细胞率为>75%;积分=A×B。
按积分高低将MT表达等级分为:“-”阴性:0~1分、“+”阳性:2分、“++”强阳性:3~4分、“+++”超强阳性:5~10分。-“-”代表MT阴性表达组, “+、++、+++”代表MT阳性表达组。
1.4 统计分析使用EXCEL2000录入数据, 统计分析软件为SAS8.0;不符合正态分布者进行变量转换(取对数或反正弦), 或使用非参数检验; 进行t检验、Spearman相关分析、协方差分析、多因素logistic逐步回归分析(入选标准为0.50, 剔除标准为0.10)等; 显著性水平定为0.05。
2 结果 2.1 一般情况最终进入研究的孕妇共120例, 其一般特征、生育史、本次妊娠及新生儿情况详见表 5。孕妇均为汉族, 平均年龄25.1岁, 78.3%初中以上文化, 75.8%为农民, 家庭年人均收入约2500元, 均无吸烟和饮酒习惯, 平均身高158.9cm, 平均体重65.5kg。35.83%怀孕两次及以上, 10.83%有自然流产史, 19.17%有哺乳史。
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表 5 MT与母血镉关系的对数线性模型分析 |
本次妊娠的35.83%实施了剖腹产手术。所有新生儿均未见先天畸形, 其中男婴69例、女婴51例。平均出生身长(49.4 ±2.95)cm, 平均出生体重(3430±466)g, 早产率(孕周 < 37周)为3.33%, 新生儿窒息(1minApgar评分≤7)为5.83%。
2.2 孕妇血镉、胎盘镉和脐血镉水平正态性检验表明120例孕妇血镉、胎盘镉和脐血镉不符合正态分布, 故采用几何均数和几何标准差描述相应资料, 详见表 1。
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表 1 120例孕妇静脉血、胎盘组织和脐血中镉的含量 |
所有的脐血镉均低于其孕母的血镉水平。符号等级检验表明, 脐血镉与母血镉的差异达到显著性水平(T=3630 P < 0.01)。脐血镉与母血镉的比值范围为0.037~0.966, 中位数为0.298。
根据Iyengar等[4]报道的健康成人全血镉的参考范围, 将研究对象分组, 血镉高于参考范围上限(1.2μgL)者共计74人, 占61.67%。
2.3 胎盘组织MT的蛋白表达情况 2.3.1 概况对120份胎盘组织进行免疫组织化学检查, 结果可见胎盘组织中蜕膜细胞、合体滋养层细胞、绒毛内的间质细胞(Hofbauer细胞)有MT的蛋白表达。全部研究对象中, 胎盘组织MT的阳性表达率为58.33%(70120)。
2.3.2 按血镉水平分层分析以1.2μgL为截断值, 按血镉水平分成正常血镉和高血镉两层。其中正常血镉胎盘组织MT阳性表达率为47.83%(2246), 高血镉胎盘组织MT阳性表达率为64.86%(4874), MT阳性表达率差异未达到显著性水平(χ2=3.388 P=0.0657)。按MT的蛋白表达强度4级来分析, MT表达强度等级差异有显著性(χCMH2=3.8614 P < 0.05)。详见表 2。
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表 2 按血镉水平分层后胎盘组织MT表达等级的比较1) |
对120例胎盘组织切片常规项目进行观察, 其中86.67%有动脉血管内膜炎、合体滋养层细胞结节数和出芽数平均为64和10、11.67%有细胞滋养层细胞增生、9. 17%的胎盘组织中绒毛纤维样坏死的绒毛超过3%、25.83%的胎盘组织中合体细胞血管膜形成达不到5%的绒毛、50.00%有末梢绒毛水肿、21.66%有中度以上的间质纤维化、45.83%有间质水肿、12.50%有中度以上的绒毛间隙纤维素沉积、40.83%有缺氧结节、4.17%发生急性梗死、84.17%有钙化现象。
2.4.2 按血镉水平分层按血镉水平分层发现不同镉暴露组细胞滋养层细胞增生(P < 0.05)、绒毛间质水肿(χ2=5.255 P < 0.05)、缺氧结节(χ2=6.714 P < 0.01)等病理变化有显著差异, 其余病理变化无显著性差异(详见表 3)。
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表 3 不同镉暴露情况下胎盘组织病理变化构成情况比较 |
按MT的表达情况分组, 发现MT不同表达组间合体滋养层细胞出芽(P < 0.01)、细胞滋养层细胞增生(χ2=7.772 P < 0.01)、绒毛纤维样坏死(P < 0.05)、绒毛水肿(χ2=13.714 P < 0.01)、绒毛间质水肿(χ2=6.607 P < 0.05)、缺氧结节(χ2=10.053 P < 0.01)、绒毛间隙纤维素沉积(P < 0.05)等病理变化差异有显著性, 其余病理变化差异无显著性。详见表 4。
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表 4 MT不同表达组间胎盘组织病理变化构成情况比较 |
对上述分析中有显著性意义的观察项目进行对数线性模型分析, 仅绒毛纤维样坏死项MT和母血镉的交互作用无显著性意义(χ2=2.52 P>0.05);其余项目的MT和母血镉的交互作用都有显著性意义。详见表 5。
3 讨论Iyengar [4]提出的正常成人全血镉的参考范围为0.3~1. 2μgL, 将研究对象分组, 血镉高于参考范围上限(1.2μgL)者共计74人, 占61.67%。研究结果显示, 所有孕妇的全血镉均高于脐血镉, 符号等级检验表明两者的差别具有显著性, 表明胎盘对镉具有明显的屏障作用。
研究结果显示, 镉暴露时胎盘组织中细胞滋养层细胞增生、绒毛间质水肿、缺氧结节等病理变化增加。按MT的表达情况分层后进行分析, 发现MT不同表达组间合体滋养层细胞出芽、细胞滋养层细胞增生、绒毛纤维样坏死、绒毛水肿、绒毛间质水肿、缺氧结节、绒毛间隙纤维素沉积等病理变化有显著差异。
对数线性模型分析结果显示, 胎盘组织中细胞滋养层细胞增生、绒毛水肿、绒毛间质水肿、绒毛间隙纤维素沉积、缺氧结节等病理变化是镉和MT综合作用的结果, 而绒毛纤维样坏死这一变化与镉无关。
在动物及体外实验结果显示, Levin等[5]证实孕晚期给孕鼠注射氯化镉可以降低胎盘血流, 同时导致胎鼠死亡和胎盘坏死, 光镜下可见滋养层细胞的坏死、血管梗塞和白细胞渗出等。其中出现胎鼠死亡者95%都伴有胎盘坏死, 而且胎盘坏死发生在胎鼠死亡之前。Saltzman等[6]通过动物实验证实, 镉能降低胎盘血供。Wier等[7]采集正常孕妇足月分娩胎盘进行灌注实验, 发现10?100μM镉可导致胎盘组织出现间质性水肿、合体滋养层细胞线粒体肿胀、空泡变性和滋养层细胞坏死等改变, 这些超微结构的改变与镉剂量呈现一定的相关性。荷兰研究人员发现吸烟者胎盘镉含量较非吸烟者高29.4%, 终末绒毛血管床密度相应较低[8], 该作者认为尚不能将该研究中吸烟导致的胎盘血管的改变完全归因于镉暴露。
镉对胎盘的毒性作用, 可能与镉在胎盘的化学形式有关。有研究者提出, 如果镉以结合MT的形式存在, 则可能不会对胎盘造成严重损害[9]。
综上所述, 我们从环境流行病学和环境病理学的角度研究镉对胎盘的影响, 结果提示, 镉暴露时胎盘组织有一定的防御反应, 如细胞滋养层细胞增生、绒毛间质水肿等表现。镉对胎盘组织的血供系统有一定影响, 如缺氧结节病变加重。镉暴露对胎盘组织结构会产生影响, 同时镉又能诱导胎盘组织MT表达, MT能使胎盘的适应性反应增强, 进而减轻镉对胎盘组织的损伤。
致谢: 华中科技大学同济医学院环境卫生教研室赵金辉、刘爱平副教授在样品采集和现场调查过程中做了大量工作,天津市中心妇产医院病理科工作人员协助完成了胎盘组织的取材和制片工作, 在此一并表示感谢!
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