中国辐射卫生  2006, Vol. 15 Issue (1): 1-2  DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2006.01.001

引用本文 

王芹, 岳井银, 李进, 穆传杰, 樊飞跃. γ射线照射后小鼠XRCC修复基因的mRNA表达[J]. 中国辐射卫生, 2006, 15(1): 1-2. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2006.01.001.
WANG Qin, YUE Jing-yin, LI Jin, et al. The mRNA Expression of XRCC Repair Genes in Mice after γ-Ray Radiation[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2006, 15(1): 1-2. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2006.01.001.

基金项目

国家自然科学基金资助(项目编号:30270218)

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收稿日期：2005-11-22
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γ射线照射后小鼠XRCC修复基因的mRNA表达
王芹 , 岳井银 , 李进 , 穆传杰 , 樊飞跃     
中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所, 天津 300192
收稿日期：2005-11-22
基金项目：国家自然科学基金资助(项目编号:30270218)
作者简介：王芹(1972~), 女, 天津人, 助理研究员, 学士, 主要从事放射医学研究.
摘要：目的 分析XRCC修复基因在IRM2近交系小鼠辐射抗性产生中的作用。方法 用Northern杂交方法, 比较IRM2小鼠及其亲本ICR/JCL及615小鼠不同剂量γ射线照射后不同时间XRCC1及XRCC5修复基因mRNA表达水平。结果 对照组IRM2小鼠XRCC1及XRCC5基因mRNA水平明显高于其亲本对照组小鼠(P < 0.01及P < 0.05)。当接受1, 2及4Gy照射后, 亲本小鼠XRCC1及XRCC5基因mRNA水平均有不同程度升高, 但显著变化出现在照射后2h(P < 0.05)。IRM2小鼠在较低剂量1, 2Gy时变化不明显, 只在相对较高的4Gy剂量组照射后1h, XRCC1及XRCC5基因mRNA水平显著升高(P < 0.05及P < 0.01)。结论 IRM2小鼠的这两种修复基因基础表达处于高水平, 当受到较大剂量照射后, XRCC5基因高表达参与DNA双链断裂修复, 这可能是其辐射抗性的主要原因之一。
关键词：辐射    X射线修复交叉互补基因    mRNA表达    
The mRNA Expression of XRCC Repair Genes in Mice after γ-Ray Radiation
WANG Qin , YUE Jing-yin , LI Jin , et al     
Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300192 China
Abstract: Objective To investigate the role of XRCC repair genes in radioresistance of IRM-2 inbred mice. Methods Northern hybridization was used to measure mRNA expression of XRCC1 and XRCC5 genes in IRM-2 mice and their parental mice ICR/JCL and 615 after exposure to different doses of γ-ray radiation at different postirradiation time. Results The levels of XRCC1 and XRCC5 mRNA expression in control IRM-2 mice were higher significantly than those in their control parental mice (P < 0.01 and P < 0.05).The mRNA expression of XRCC genes in ICR/JCL and 615 mice all increased to some extent after exposure 1, 2 and 4Gy radiation.But the levels were significantly higher at 2h postirradiation (P < 0.05).The levels of XRCC mRNA expression in IRM-2 mice did not increase significantly compared with the control mice after exposure 1 and 2Gy radiation.But the levels of XRCC1 and XRCC5 mRNA expression increased markedly at 4Gy 1h postirradiation (P < 0.05 and P < 0.01). Conclusion The basal levels of XRCC1 and XRCC5 mRNA expression in IRM-2 mice were high.The high level of XRCC5 mRNA expression was involved in the repair of DNA double strand breaks induced by higher dose radiation, which perhaps was one of radioresistance causes of IRM-2 mice.
Key words: Radiation    X Ray Repair Cross Complementing Genes    mRNA Expression    

辐射是已知的环境致癌因素, 其损伤的终点是基因组DNA的结构和功能[1]。而DNA损伤修复可以对抗辐射的危害, 在基因组稳定性方面起着重要作用。X射线修复交叉互补基因(X ray repair cross complementing genes, XRCC)是参与DNA损伤修复的一组重要基因, 目前已鉴定出11种不同的遗传族群。其中, XRCC1和XRCC5基因分别为参与DNA单链断裂(SSB)和双链断裂(DSB)重接的两个关键基因, 其表达直接影响对DNA损伤的修复能力, 也反应了对电离辐射的敏感性。IRM-2小鼠是我所培育的近交系小鼠品系, 该小鼠突出的生物学特性是具有较强的辐射抗性[2]及较低的染色体畸变率[3]。我们通过观察电离辐射后XRCC1及XRCC5修复基因mRNA表达水平, 对IRM-2小鼠及其亲本ICR/JCL及615小鼠进行对比研究, 分析DNA修复基因在IRM-2小鼠辐射抗性中发挥的作用。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物

IRM-2小鼠、ICR/JCL及615小鼠, 6~8周龄, 体质量(20±2) g, 雄性, 随机分组, 每组6只。常规喂养, 由本所国家二级动物室培育[2], 级别为清洁实验动物。

1.1.2 主要试剂

琼脂糖凝胶为Roche公司产品。TRizol试剂为美国Invitrogen公司产品。Rediprime Ⅱ Random Prime Labelling System和杂交液为美国Amersham Biosciences公司产品。

1.1.3 主要仪器

137Cs γ射线照射源为加拿大产(型号USD), 紫外分光光度计为美国Beckman公司产品(型号DU800), 真空印迹装置和Doc1000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法 1.2.1 动物照射

IRM-2、ICR/JCL及615小鼠接受1、2和4Gy 137Cs γ射线照射, 分别于照射后0.25、1、2h断颈处死(每个时间点6只动物), 提取脾细胞总RNA。对照组小鼠(6只)不照射。剂量率为0.99Gy/min。

1.2.2 小鼠脾细胞总

RNA的提取:按TRizol试剂的说明书提取总RNA, 紫外分光光度计进行鉴定, OD260/OD280为1.8~2.0。

1.2.3 总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳

总RNA变性30μg, 进行1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳, 90V (3~4V/cm)电泳2h。

1.2.4 真空印迹

真空压力调至5in Hg (12.7cm Hg), 在凝胶上倒入1000~1500ml 10×SSC, 转膜2.5h。转膜结束后进行紫外交联。

1.2.5 Northern杂交

按Rediprime Ⅱ Random Prime Labelling System的说明书, 用1.85×106 Bq (50μCi) [32P]dCTP标记XRCC1和XRCC5探针各17ng, β-actin探针8ng (为内参)。将尼龙膜放入杂交杯中, 加入5ml杂交液和沸水浴变性后的32P标记的探针, 65℃摇动温育2.5h。

1.2.6 放射自显影

室温下用2×SSC, 0.1% SDS摇床洗膜20min两次, 然后用0.2×SSC, 0.1% SDS 65℃摇床洗膜一次。将膜封在保鲜膜中, 压上胶片, 将增感屏固定在暗盒盖上, -20℃冰箱过夜, 在暗室进行洗片。

1.2.7 图像分析

Doc1000凝胶成像系统采集图像, 用Molecular AnalysisTM软件分析DNA条带分布及灰度关系。修复基因mRNA表达以修复基因条带黑度占对照基因条带黑度比例表示。

1.3 统计学处理

实验数据以x±s表示, 采用t检验。以P < 0.05为有统计学意义。

2 结果 2.1 对照组小鼠XRCC基因mRNA水平

对照组IRM-2小鼠XRCC1及XRCC5基因mRNA水平明显高于其亲本对照组小鼠(P < 0.01及P < 0.05), 说明IRM-2小鼠的这两种修复基因基础表达即处于高水平, 见表 1。

表 1 对照组小鼠XRCC基因mRNA水平(x±s)
2.2 γ线照射后小鼠XRCC基因mRNA表达

当分别接受1, 2及4Gy γ射线照射后, 亲本615及ICR/JCL小鼠XRCC1及XRCC5基因mRNA水平均有不同程度升高, 但显著变化出现在照射后2h (P < 0.05)。IRM-2小鼠在较低剂量1, 2Gy时变化不明显, 只在相对较高的4Gy剂量组照射后1h, XRCC1及XRCC5基因mRNA水平显著升高(P < 0.05及P < 0.01), 见表 2, 表 3。

表 2 γ射线照射后小鼠XRCC1基因mRNA表达(x±s)

表 3 γ射线照射后小鼠XRCC5基因mRNA表达(x±s)
3 讨论

众所周知, DNA是辐射杀伤的主要靶分子, 其效应表现为SSB、DSB及DNA-蛋白质交联。早在1968年Alexander提出了细胞辐射敏感性取决于其DNA链断裂修复能力的概念。近年来越来越多的证据表明, 有些细胞是由于SSB修复能力缺陷而对辐射敏感, 但大多数辐射敏感的细胞是由于内在缺乏或缺陷DSB修复能力所致[4], DSB的损伤和修复与辐射敏感性密切相关。

XRCC1基因是影响细胞对离子辐射敏感性被分离的第一个基因, 该基因能纠正EM9细胞SSB损伤修复的缺陷, 在SSB和碱基损伤修复中起重要作用。对XRCC1基因缺陷细胞系辐射诱发SSB的修复研究表明, 其快速修复期的损伤修复速率仅是亲本细胞系的1/3~1/2, 与慢速修复期修复速率相当。

XRCC5基因产物是Ku80蛋白(Ku家族), 能结合DSB的游离端, 在DSB修复和V (D) J重组中起重要作用[5]。研究表明, xr-5和xr-6中国仓鼠突变株由于缺乏编码Ku80的XRCC5基因, DSB的修复能力缺陷, 因此对射线敏感。而当把Ku80 cDNA转染到xr-5和xr-6细胞株后, xr-5细胞原来缺乏的对V (D) J重组修复的能力得到纠正, xr-6细胞对辐射的耐受性明显增加[6]。

由于辐射抗性在很大程度上取决于DNA损伤的最终修复结果, 因此我们主要考虑动物本身的修复功能来探讨IRM-2小鼠辐射抗性产生的可能机理。本研究结果表明, IRM-2小鼠XRCC1及XRCC5基因mRNA的基础表达水平较高, 当出现DNA链断裂时, 能够及时进行修复, 这可能对IRM-2小鼠辐射抗性具有一定的贡献。4Gy剂量照射后1h, IRM-2小鼠修复基因快速高表达, 可能是由于较高剂量照射后DNA双链断裂比例增加, 因此需要提高XRCC5基因的表达参与双链断裂修复, 这可能对IRM-2小鼠辐射抗性的贡献更大。

由于辐射引起DNA损伤上的多样性, 仅靠修复系统来解释辐射抗性是不完善的, 因为修复本身也是不完全的, 所以联合国辐射效应科学委员会的专家们推测, 除了修复系统外, 参入决定辐射抗性的大量人类基因尚未被发现[7], 需要提供辐射抗性动物或细胞系进行相关研究, 以便克隆辐射抗性基因。我们已经开展以IRM-2小鼠为材料的辐射抗性相关基因克隆工作[8], 相信可以从分子机理上对此小鼠辐射抗性进行更深入的解释。

参考文献
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李进, 周继文, 吴红英, 等. IRM-2近交系小鼠的G-显带核型和自发畸变率的研究[J]. 中国实验动物学报, 2001, 9(3): 178-181. DOI:10.3969/j.issn.1005-4847.2001.03.013
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岳井银, 王芹, 穆传杰. IRM-2及其亲本小鼠mRNA差异显示分析[J]. 中国医学研究与临床, 2004, 2(12): 5-7.