研究低剂量辐射兴奋效应使用较多的是X射线, 人们发现低剂量X射线可以增强免疫功能和诱导适应性反应[1], 并且发现其机制可能与蛋白质的表达密切相关[2]。但是, 利用γ射线研究低剂量辐射兴奋效应的文献相对较少。周平坤利用Northern杂交技术, 在0.2 Gy γ射线照射后2~ 4 h, 发现人A49细胞中LRIGx基因mRNA表达水平显著上调, 表明LRIGx基因是低剂量γ射线的辐射诱导表达基因[3]。γ射线在放射治疗中占主导地位, 尤其60Co放疗机的广泛应用, 使研究低剂量γ射线的生物效应更加重要。因此, 笔者通过流式细胞术探讨了低剂量γ射线对小鼠胸腺细胞和脾细胞周期的影响。
1 材料与方法 1.1 动物与分组广东医学院实验动物中心饲养繁殖的雄性昆明小白鼠90只, 体重(20±2)g, 根据随机区组实验设计分成6组, 每组15只。分别为假照射组和10 mGy、50 mGy、75 mGy、100 mGy、250 mGy照射组。
1.2 主要试剂和仪器碘化丙啶(propidium iodide, PI)和RNA酶为美国Sigma产品, 购自华美生物工程公司。RPM I 1640培养基(GIBCO, 美国), 其他为国产分析纯试剂。Epics-XL型流式细胞仪(Coulter, 美国)。
1.3 照射条件照射源为60Co γ射线, 滤过板3.6 cm铅砖, 靶皮距180 cm, 吸收剂量率为12.5 mGy/min。Farmber 2570剂量仪测定。
1.4 细胞悬液制备照射后6 h, 处死小鼠, 无菌取出胸腺和脾脏。将每3个胸腺或脾脏合为一个样本, 放入1.5 ml RPMI 1640培养液中研磨, 5个样本为一组。200目不锈钢网过滤, 将胸腺细胞或脾细胞调成5×106/ml的单细胞悬液。每个样本取0.2 ml, 用0.01 mol/l PBS洗2次, 弃上清液。加0.01% RNA酶100 μl和50 mg/L PI 0.5 ml混匀, 4 ℃避光30 min, 流式细胞仪检测细胞周期进程。
1.5 统计分析实验结果用各期细胞占总细胞的百分率(平均值±标准差)表示, 用单因素方差分析的方法进行统计学处理。
2 结果 2.1 低剂量γ射线对小鼠胸腺细胞周期进程的影响表 1显示50~ 250 mGy照射组G0/G1期细胞百分率明显低于假照射组(P < 0.01, P < 0.05), 50 mGy和100 mGy照射组S期细胞百分率显著高于假照射组(P < 0.05, P < 0.01), 50~ 250 mGy照射组(G2 +M)期细胞明显高于假照射组(P < 0.05, P < 0.01)。
|
表 1 低剂量γ射线作用后6 h小鼠胸腺细胞周期的变化(x±s, η/%) |
10 ~ 250 mGy照射组G0/G1脾细胞百分率显著高于假照射组(P < 0.05, P < 0.01), 10 mGy, 75 mGy和250 mGy照射组S期细胞百分率明显低于假照射组(P < 0.05, P < 0.01), 50 mGy和100 mGy照射组S期细胞百分率也低于假照射组, 但无统计学意义。照射组(G2 +M)期细胞百分率均低于假照射组, 但也无统计学意义。
3 讨论低剂量辐射免疫增强效应和诱导的适应性反应机制与肌体细胞的变化、生物大分子的表达和整体调节密切相关, 其中细胞学基础是重要的影响因素之一, 许多学者从不同角度研究它在低剂量辐射免疫增强效应和诱导适应性反应机制中的作用和规律。25~ 250 mGy单次X射线全身照射小鼠24 h后, 25 ~ 100 mGy照射组小鼠胸腺细胞数明显高于假照射组, 75 mGy照射组尤为明显, 证实低剂量辐射能够增加免疫细胞的数量[4]。朱寿彭等给大鼠静脉输入0.185 ~ 0.74 kBq/g的147 Pm或0.37 ~ 1.85 kBq/g的134Cs后, 发现骨髓细胞和胸腺细胞的3HTdR掺入率显著上升, 说明低剂量内照射也可以刺激中枢免疫器官的细胞增殖[5]。低剂量辐射不仅可以增强免疫功能, 而且能够诱导适应性反应。预先给予10 mGy的X射线照射, 3 h后予以不同浓度的MMC, 可诱导小鼠骨髓细胞染色体畸变的适应性反应; 预先给予50 mGy的X射线照射, 3 h后给不同浓度的MMC和H2O2, 可诱导小鼠生殖细胞染色体畸变的适应性反应[6], 表明低剂量辐射具有拮抗小鼠染色体畸变的作用。低剂量辐射兴奋效应也表现在细胞周期进程中, 小鼠接受75 mGy X射线照射后3~ 7 d, 胸腺细胞S期细胞百分率增高, 而G0/G1期细胞百分率相应减少, 说明在低剂量X射线作用下小鼠胸腺细胞进入DNA合成期的细胞相对增多, 合成DNA的能力增强[7]。笔者发现低剂量γ射线照射小鼠6 h后, 照射组胸腺细胞G0/G1期细胞百分率低于假照射组, S期细胞百分率高于假照射组, 主要以100 mGy照射组最明显, 而照射组(G2 +M)期细胞明显高于假照射组, 说明低剂量γ射线的刺激作用发生在胸腺细胞周期进程中的G0/G1期和S期, 在(G2 +M)期表现为抑制作用(表 1)。根据刘树铮等慢性γ射线照射后4 h使胸腺细胞3H-TdR自发掺入率显著增高等文献报道, 说明这种刺激作用可能大于抑制作用[8]。表 2显示照射组G0/G1脾细胞百分率高于假照射组, 照射组S期细胞百分率低于假照射组, 说明低剂量γ射线对小鼠脾细胞DNA合成有抑制作用, 且主要发生于G0/G1期和S期。这与低剂量X射线对小鼠脾细胞周期的作用不同, 小鼠受低剂量X射线照射24 h后, 发现50 mGy和75 mGy X射线促进小鼠脾细胞由G0/G1期进入S期, DNA合成能力增强, 而当低剂量X射线剂量100 mGy时, 开始出现G1期阻滞[9]。这是辐射后观察时间不一样还是射线性质不同而引起的差异, 有待进一步探讨。
|
|
表 2 低剂量γ射线作用后6 h小鼠脾细胞周期的变化(x±s, η%) |
| [1] |
刘树铮. 低水平辐射兴奋效应[M]. 北京: 科学出版社, 1996: 152-311.
|
| [2] |
孟庆勇, 陈沙力, 刘树铮. 低剂量辐射对小鼠胸腺细胞浆和细胞核蛋白质表达的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2003, 22: 14-16. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2003.01.005 |
| [3] |
周平坤, 隋建丽, RIGAUD Odile, 等. 辐射诱导基因LRIGx的细胞周期特异性表达及编码产物同源性分析[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2002, 18: 272-276. DOI:10.3969/j.issn.1007-7626.2002.03.003 |
| [4] |
Liu SZ.Chapter 7A: Discussion of Luckey' s paper.In: Ellsaesser HW, ed.Global 2000 revisited[M].Paragon House, New Youse, New York, 1992, 253-268.
|
| [5] |
朱寿彭, 杨占山, 夏芬. 小剂量内照射对大鼠骨髓与胸腺细胞的刺激增殖[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 1993, 11: 172-175, 171. |
| [6] |
孟庆勇, 蔡露, 金玉珂. 低剂量X射线和低浓度MMC、H2O2、CP诱导人血淋巴细胞、小鼠骨髓细胞和生殖细胞的交叉适应性反应[J]. 辐射防护, 2002, 22: 212-218. DOI:10.3321/j.issn:1000-8187.2002.04.004 |
| [7] |
Liu SZ, Zhang YC, Qi J. Thymocyte renewal and differentiation in mice following low dose ionizing radiation[J]. J.Norman Bethune Univ.Med.Sci, 1992, 18: 405-408. |
| [8] |
刘树铮, 蔡露, 孙俭波, 等. 低剂量辐射刺激作用的实验研究[J]. 中华放射医学与防护杂志, 1989, 12: 247-250. |
| [9] |
叶飞, 刘树铮. 不同剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞周期进程的影响[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 1999, 17: 111-114. DOI:10.3969/j.issn.1000-3436.1999.02.010 |